docביוכימיה א שיעורים 1-6
download 
Report Transcription
ביוכימיה א שיעורים 1-6
שיעור :01הקדמה לביוכימיה – פרק החלבונים 1 שיעור :01הקדמה לביוכימיה – פרק החלבונים גופנו בנוי מתאים רבים – כמות התאים היא כ 1014-תאים .ישנם סוגי תאים שונים ומגוונים ,כאשר הם נבדלים בגודלם ,בתפקידם ,בצורתם – יש 85סוגי תאים שונים ,כאשר המשותף להם הוא קיומה של ממברנה ואברונים העוסקים בתהליכים שונים אך משותפים לכל התאים. • ציטופלזמה – התווך המימי של התא בו "שוחים" האברונים. • גרעין – מכיל את חומצות הגרעין. • הרשתית האנדופלזמטית – סינתזה של חלבונים. • מיטוכונדריה – תהליכי קבלת אנרגיה מחומרים עשירים באנרגיה כמו סוכרים ושומנים וגם מחלבונים. משקל המים בתא הוא כ 70%-ממסת התא .המפה משמאל היא סכמה המתארת תהליכים מטאבוליים בתא – כל קו הוא תהליך וכל נקודה היא אנזים ,קטליזטור היודע לזרז תהליכים במערכות ביולוגיות. זהו נתח קטן מהתמונה כולה ועדיין ניתן להבחין במאות חלבונים שונים הנבדלים בתפקידם ,במבנה שלהם וכדומה .כמות החלבונים בגוף היא עצומה והם מאופיינים במבנה התלת מימדי שלהם ,הנקבע על פי רצף חומצות האמינו ותגובות החלבון עם הסביבה המימית של תוך התא .מסיבה זו סביבת התא – הציטופלזמה – חשובה מאוד לתפקוד ולמבנה המרחבי של החלבונים הנמצאים בתא. החלבונים מהווים 15%מהמסה של התא ,המסה היבשה הגבוהה ביותר; לצורך השוואה ,חומצות הגרעין מהוות 7%והממברנה והסוכרים מהווים 3%כל אחד. בפרק זה נלמד מספר דברים: • מהו חלבון • איך החלבון נראה ,מה המבנה התל מימדי שלו • התגובה של החלבון עם הסביבה • תפקידם ומה הם עושים ,במיוחד האנזימים • אינטראקציות בין חלבונים המרכיבות מבנים מורכבים של חלבונים רבים – קומפלקסים חלבוניים. החוג לביולוגיה ,אוניברסיטת תל אביב2011 , חמוטל בן דב ביוכימיה א' -שיעור 2 היסטוריה מאלדר ) – 1830 ,(Mulderמצא חומר שנשאר בתמיסה לאחר שמוציאים סוכרים ,שומנים ומלחים וכך גילה שיש עוד חומר חיוני לחיים – החלבון .אחריו ,ב ,1838-ברזליוס ) (Berzeliusהעניק לחומר זה את השם ,Proteinהנשאב מהמילה היוונית שפירושה "הראשון במעלה בחשיבותו". החלבונים הם פולימרים; כמו רב-סוכרים שבנויים מסוכרים וחומצות גרעין שבנויות מנוקליאוטידים, החלבון הוא שרשרת פולימרית שעשויה מ 20-יחידות שונות של חומצות אמינו .בתור שכזה ,בהשוואה לחומצות הגרעין ,הוא הרבה יותר מורכב – בנוי ממגוון רחב יותר של אבני בניין .לפני שנעמיק בהכרת המבנה של החלבונים וכיצד הוא נקבע ,נכיר את אחת המולקולות העיקריות המשפיעות על מבנהו התלת המימדי – מולקולת המים. מולקולת המים – תכונות מולקולת מים הינה מולקולה פשוטה בעלת מבנה של משולש מישורי .לאטום החמצן יש ארבעה אורביטלים ,שניים מכילים זוגות אלקטרונים לא קושרים ושניים יוצרים קשר קוולנטי למימנים .אורך הקשר בין מימן לחמצן הוא 0.958אנגסטרם וזווית הקשר היא 104.5מעלות .ההיברידיזציה של החמצן היא ,SP3היברידיזציה טטראהדרלית. קשרים כימיים בין מולקולות מים ומולקולות אחרות הקשר בין החמצן למימנים הוא קשר פולארי .לכל אטום יש תכונת אלקטרושליליות ,שמסמלת את היכולת של האטום להחזיק את האלקטרונים של הקשר הקוולנטי; ככל שהאלקטרושליליות של האטום גבוהה יותר, הזיקה שלו גבוהה יותר. האלקטרושליליות של החמצן גבוהה מזו של המימן ,מה שיוצר נטייה של אלקטרוני הקשר בין החמצן למימן להימצא בסבירות גבוהה יותר בקירבת החמצן – החלוקה של אלקטרוני הקשר אינה שווה. מסיבה זו הקשר הוא פולארי – אטום החמצן נוטה להיות שלילי יותר מאשר המימן ,כי האלקטרונים נמצאים יותר בקירבתו. עקב הפולאריות של הקשר ,למולקולות המים היכולת ליצור ארבעה קשרי מימן אל מולקולות פולאריות אחרות .קשרים אלו נוצרים על ידי שני זוגות האלקטרונים הלא קושרים וכן על ידי המימנים החיוביים של המולקולה .בקשרי מימן יש שני משתתפים :תורם המימן הוא מולקולה שבה יש מימן חיובי – מימן שקשור בקשר פולארי מאוד ולכן נוטה להיות חיובי; ומקבל המימן ,שמכיל זוג אלקטרונים לא-קושר. חמוטל בן דב החוג לביולוגיה ,אוניברסיטת תל אביב2011 , שיעור :01הקדמה לביוכימיה – פרק החלבונים 3 קשר מימן הוא קשר ארוך יחסית – אם אורך הקשר הקוולנטי הוא 0.0965ננומטר ,אורך קשר המימן בין מולקולות מים הוא 0.177ננומטר – כמעט פי שניים מהקשר הקוולנטי .כתוצאה מכך עוצמת הקשר חלשה יותר משמעותית )כ 20-קילוג'אול עוצמתה(. שתי מולקולות מים יכולות ליצור ארבעה קשרי מימן, כאשר באופן כללי אורך קשר מימן בין ליבות המולקולות הוא כ 0.29-ננומטר .בקרח מים אכן יוצרים ארבעה קשרים עם מולקולות מים ,אולם ככל שמעלים את הטמפרטורה כמות הקשרים הנוצרים יורדת – בטמפרטורה של 25מעלות כל מולקולה יוצרת בממוצע 3.4קשרים. כפי שציינו ,קשרי מימן אינם רק קשר בין מים למים אלא בין קבוצות .מים יכולים ליצור קשר לקבוצות של ,OHכמו שקיימות בכהל )ולכן הוא מסיס מאוד במים(; ישנה יצירה של קשרי מימן עם קרבוניל )' ,(RCORקבוצות קרבוקסיליות ) ,(RCOOHקבוצות אמיניות ) (RNH2ועוד. יוניזציה של מים אם יש שתי מולקולות מים שמגיבות אחת עם השנייה בקשר מימן ,לרוב הן יעברו דיסוציאציה: המולקולות מתקרבות ומתרחקות כל הזמן כתוצאה מתנודתן הטבעית ,ולעיתים קורה )בתדירות נמוכה( שמימן הקשר עוזב את המולקולה התורמת ומתחבר למולקולה המקבלת .כעת אנו מקבלים שתי מולקולות שונות – הידרוקסיד ) (OH-והידרוניום ) .(H3O+התהליך הפורמלי מנוסח בתור התפרקות של המים להידרוקסיד ופרוטון ).(H+ התהליך ניתן לתיאור תרמודינמי כתהליך שיווי משקל ,שיש לו קבוע שיווי משקל .קבוע שיווי המשקל שווה לריכוז הפרוטונים כפול ריכוז ההידרוקסידים חלקי ריכוז המים .מכיוון שריכוז המים הוא קבוע ) (55Mניתן להעביר אותו לאגף של ,Kולקבל את קבוע המים ) (Kwשהוא שווה למכפלת ריכוז הפרוטון בהידרוקסיד ,שהוא .10-14 במים מזוקקים בלי הכנסת OH-נוסף או פרוטון נוסף ,הריכוז של השניים שווה ולכן הריכוז הוא 10-7וערך הגבה הוא ) 7לפי ] .(pH=-log10[H+אם מוסיפים חומצה עולה ריכוז ה ;OH-חומצה חזקה החוג לביולוגיה ,אוניברסיטת תל אביב2011 , חמוטל בן דב ביוכימיה א' -שיעור 4 שתנצל את כל הפרוטונים תביא לערך גבה ) 0בריכוז ;(1Mערך גבה שלילי יכול להתקיים ,בריכוזי חומצה גבוהים יותר – ערך גבה של ) (-1ניתן על ידי ריכוז חומצה של .10Mבאופן הפוך ערך הגבה עולה עד 14בהוספת בסיס ,ועולה הלאה בריכוזי בסיס חזק שגדולים מ.1M- ערך ה pKa-של חומצות חזקות יהיה נמוך יותר משל חומצות חלשות. קו הטיטרציה של חומצה חלשה – משוואת הנדרסון-הסלבלאך בדוגמה הבאה רואים חומצה אצטית בצורתה הלא-מיוננת ,העוברת דיסוציאציה לצורתה המיוננת .זוהי חומצה חלשה ,כך שאם נכניס 1Mחומצה למים מזוקקים לא נקבל ריכוז 1Mשל פרוטונים – כי היא עוברת פרוטונציה חלקית .משוואת הנדרסון-הסלבלאך מתאר את הקשר בין ערך הגבה לpKa- בתוספת איבר נוסף המושפע מהריכוזים של הצורה המיוננת והלא-מיוננת של החומצה. כאשר ריכוז הפרוטון בחומצה גבוה מאוד מקבלים pHנמוך יחסית; ככל שנעלה באופן מלאכותי את ריכוז הצורה הלא-מיוננת ,אנחנו משנים את יחס הריכוזים ועל ידי כך יכולים להעלות את ה pH-עד לנקודה אופיינית שהיא נקודה הטיטרציה של החומצה .בנקודה שבה ריכוזי הצורה המיוננת והלא מיוננת שווים.pH=pKa , חמוטל בן דב החוג לביולוגיה ,אוניברסיטת תל אביב2011 , שיעור :01הקדמה לביוכימיה – פרק החלבונים 5 קשרים בין מולקולאריים בכימיה אנחנו עוסקים במספר סוגים של קשרים בין-מולקולאריים ,שהם קשרים חלשים בהרבה מקשרים קוולנטים ,והם :קשרים יוניים ,קשרי דיפול ,קשרי מימן והאפקט ההידרופובי.1 קשרים יוניים בין מטען שלילי וחיובי יש כוחות משיכה ,בעוד שבין מטענים שווים יש כוחות דחייה .קשר אלקטרוסטטי – שנוצר בין שני יונים בעלי סימנים הפוכים – הוא חזק כחוזק המטענים של היונים המגיבים .מטען של יון הסידן גבוה ממטען של יון כלוריד ,למשל. מכפלת המטענים בקבוע kמחולקת במקדם הדיאלקטרי ) ,(εשהוא ערך קבוע המאפיין את חוזק הקשר בתמיסה – חוזק הקשר בין שני יונים זהים יכול להיות חזק או חלש יותר בהתאם לתמיסה בה הם נמצאים – אם בתוך מים לעומת תמיסה אורגנית ,למשל ,זאת כתוצאה ממיסוך מטענים על ידי מים ,תופעה המתבטאת באופן חלש יותר בתמיסות אורגניות .ניתן לראות בטבלה משמאל כי ככל שהתמיסה פולארית יותר המקדם הדיאלקטרי גבוה יותר. קשרי דיפול ודיפול מושרה קשרים אלקטרוסטטים המערבים מולקולות פולאריות – יונים או דיפול קבוע .המרחק בין ליבות המולקולות הינו בעל משקל עוד יותר משמעותי – אם בקשר יוני rחושב במעלה ראשונה ,בקשר בין שתי מולקולות פולאריות rמחושב במעלה שלישית כבר. כאשר הקשרים אינם בין מולקולות פולאריות או יונים אלא מערבים גם מולקולה בעל דיפול מושרה r ,עולה במעלה רביעית ואפילו חמישית .כמובן שככל שמשקלו של rעולה ,עוצמת הקשר יורדת. 1האפקט ההידרופובי אינו קשר כמו שהוא שם לתופעה המתרחשת כאשר מולקולות הידרופוביות – כלומר לא פולאריות – נמצאות בסביבה פולארית .במצב זה המולקולות מתאחדות יחד ל"גוש" או "טיפה" בתמיסה הפולארית ,כל מנת ליצור שטח פנים מינימלי הבא באינטראקציה עם הסביבה הפולארית. החוג לביולוגיה ,אוניברסיטת תל אביב2011 , חמוטל בן דב ביוכימיה א' -שיעור 6 אפקט הידרופובי האפקט ההידרופובי נובע מ"אי הרצון" של מולקולות הידרופוביות לבוא באינטראקציה עם מולקולות פולאריות כמו מים .האפקט נובע מאופיין הלא-פולארי של המולקולות ההידרופוביות ,כמו למשל השומנים בעלי האופי הלא-פולארי שיוצרים את הממברנה הדו-שכבתית של התאים והאברונים. הבריחה ההידרופובית ממים מתרחשת משום שסידור מולקולות מים סביב המולקולה הלא-פולארית גורם לעלייה בסדר ,שמביאה לירידה באנתרופיה .מכיוון שתופעה זו אינה רצויה מבחינה אנתרופית ,מולקולות הידרופוביות יוצרות צבירים הידרופוביים והמולקולות אינן "שוחות" במים באופן דיפוזי-חופשי. מסיסות אם מכניסים לתמיסה גביש מלח ,הוא מתפרק ליונים; הסיבה לכך היא שיונים מגיבים חזק מאוד עם מים ביצירת קשרי מטען-דיפול .מסיבה זו מלח מתמוסס בקלות במים – כי היונים יוצרים קשרים רבים עם מולקולות המים סביב .אם לוקחים מלח בישול ומנסים למוסס אותו בתמיסה הידרופובית ,המלח לא יתמוסס כי הוא לא יכול להגיב עם הסביבה .במצב שבו אין תגובה עם הסביבה היונים נשארים בצורתם הגבישית הטבעית .שימו לב שהסידור הוא לפי מטען היון – מול יון שלילי יסתדרו מימנים ומול יון חיובי יסתדרו החמצנים של מולקולת המים. חמוטל בן דב החוג לביולוגיה ,אוניברסיטת תל אביב2011 , שיעור :01הקדמה לביוכימיה – פרק החלבונים 7 חמצן לעומת זאת הוא מולקולה ללא דיפול – שני אטומים מאותו הסוג חולקים באלקטרונים באופן שווה .בתור חומר לא פולארי ,המסיסות של החמצן נמוכה מאוד .אותו הדבר ניתן לומר גם בנוגע למולקולות חנקן .לעומת זאת ,מולקולת אמוניה או סולפיד – שהן מולקולות פולאריות – הינן בעלות מסיבות הגבוהה בכמה וכמה סדרי גודל. כיצד חמצן מגיע לתאים אם הוא לא מסיס? לשם כך ההמוגלובין מסוגל לקשור את החמצן לליבת הברזל של מולקולת ה heme-ומאפשר לכדוריות הדם האדומות לשנע את החמצן בגוף למרות המסיסות הנמוכה שלו. תכונות של חומצות האמינו חלבונים הם פולימרים שמורכבים מ 20-חומצות אמינו שונות; חומצת אמינו מורכבת ממבנה כללי של חומצה קרבוקסילית ) (COOHוקבוצת אמינו ) .(NH2שתי הקבוצות האלו מחוברות לפחמן מרכזי ,פחמן אלפא ,הקושר בקשר קוולנטי את הפחמן של החומצה ואת החנקן של האמינו .שני הקשרים הקוולנטים האחרים של פחמן אלפא הם למימן ולקבוצת .Rההבדלים בין 20חומצות האמינו השונות נובעים מקבוצות ה R-השונות המחוברות לפחמן אלפא – כל שאר האלמנטים זהים. סטריאוכימיה של חומצות אמינו – כיראליות 19מתוך 20חומצות האמינו הן כיראליות – כאשר גליצין היא היחידה שאינה כיראלית שכן קבוצת R שלה היא מימן .כיראליות היא תכונה הנובעת מכך שלפחמן המרכזי קשורות ארבע קבוצות שונות. מבנה כיראלי של חומצת אמינו ניתן לזהות על ידי הצבת הטטראהדר כשהמימן פונה אלינו ,ואז עוברים לפי הסדר – CORNחומצת האמינוR , והחנקן .המילה CORNמתקבלת אם האיזומר הוא איזומר ,Lשבו התנועה בהסתכלות זו היא עם כיוון השעון. יש להכיר את עשרים חומצות האמינו – במבחן מקבלים את שמות כל החומצות אמינו יחד עם המבנה הכימי שלהן ,אבל אנחנו צריכים להכיר את התכונות שלהן .למשל בגליצין צריך להכיר את העובדה שהוא לא כיראלי ולכן אין לו גם תכונה של אופטיות .שלושת השמות – באות אחת ,שלוש אותיות ושם מלא – יופיעו בבחינה. החוג לביולוגיה ,אוניברסיטת תל אביב2011 , חמוטל בן דב ביוכימיה א' -שיעור 8 חלוקה של חומצות האמינו חומצות האמינו נבדלות ,כאמור ,בקבוצת .Rלפיכך ,החלוקה נעשית לפי ההבדלים האלה ,לפי התכונות הכימיות-פיזיקליות של קבוצת .Rהחלוקה היא לחמש קבוצות: • אליפאטיות – לא פולאריות והידרופוביות. • ארומטיות – השייר מכיל טבעת/טבעות ארומטיות ,מולקולות הידרופוביות. • פולאריות לא טעונות ,הידרופיליות. • פולאריות טעונות חיובית ,הידרופיליות. • פולאריות טעונות שלילית ,הידרופיליות. חומצות אמינו אליפאטיות שש חומצות אמינו :גליצין ,אלאנין ,וואלין ,לאוצין ,איזולאוצין ופרולין. גליצין מאופיין בקבוצה הקטנה ביותר – קבוצה של מימן – והיא מיוחדת בחוסר הכיראליות שלה .אלאנין מכילה קבוצת מתיל ,וואלין מכילה איזופרופיל ,לאוצין מכילה ניאובוטיל ,איזלאוצין מכילה איזובוטיל ופרולין מכילה טבעת שנוצרה בין השייר Rלחנקן של קבוצת האמינו של החומצה .זוהי תכונה מיוחדת לפרולין .ככל שקבוצת Rגדולה יותר ומכילה יותר פחמנים היא יותר הידרופובית. חומצות אמינו ארומטיות שלוש חומצות אמינו: פנילאלאנין, טירוזין וטריפטופן. חומצות האמינו האלה מכילות Rשמורכב מטבעות ארומטיות .מביניהן ,פנילאלאניל היא היחידה שאינה פולארית – בשתי האחרות יש קבוצות צדדיות לטבעת שמעניקות לה תכונות פולאריות )OH בטירוזין ו NH-בתוך הטבעת של טריפטופן(. חמוטל בן דב החוג לביולוגיה ,אוניברסיטת תל אביב2011 , שיעור :01הקדמה לביוכימיה – פרק החלבונים 9 חומצות אמינו פולאריות לא-טעונות • קבוצות פולאריות עם קבוצת הידרוקסיל – שתי חומצות אמינו :סרין וטריונין .שתיהן מכילות Rשיש לו קבוצה של .OHקבוצת ההידרוקסיד היא פולארית ולכן מאפשרת מסיסות גבוהה בסביבה הידרופילית. • קבוצות פולאריות עם קבוצת אמיד – שתי חומצות אמינו :אספרגין וגלוטמין .הקבוצות מכילות קבוצות אמיד – כלומר קרבוניל ו- .NH2הקבוצות האלה יכולות ליצור קשרים רבים מאוד עם מולקולות מים ולכן הן מאוד הידרופיליות. • קבוצות פולאריות לא טעונות עם גופרית הידרופיליות – שתי חומצות אמינו :ציסטאין, מתיונין .הן נבדלות בכמות הפחמנים שיש בשייר וכן בכך שהשייר מכיל גופרית ,עובדה המקנה את ייחודיות הקבוצה ואת הפולאריות שלה .ככל שיש יותר פחמנים כמובן שתכונת ההידרופוביות עולה לעומת תכונת הפולאריות. כמות קשרי המימן נמוכה יותר אבל יש אפשרות ליצירת קשרי S-Sעל ידי חימצון הגופרית של ציסטאין. החוג לביולוגיה ,אוניברסיטת תל אביב2011 , חמוטל בן דב ביוכימיה א' -שיעור 10 שיעור :02הקדמה לביוכימיה – פרק החלבונים – המשך דיברנו על חומצות האמינו ,שהן מולקולות כיראליות ברובן ,בהן יש פחמן מרכזי המחובר לקבוצה קרבוקסילית ,אמינו ,מימן וקבוצת .Rחילקנו את חומצות האמינו לקבוצות השונות בהתאם לפולאריות או אי-פולאריות ,מטען או חוסר מטען ושיירים ארומטיים. חלוקה של חומצות אמינו – המשך • לחומצות האמינו בעלות השייר הארומטי )טירוזין, טריפטופן ופניאלאנין( יש תכונה מיוחדת של בליעת אור באיזור 270ננומטר .תכונה זו מביאה לעלייה של אלקטרון לרמה אנרגטית גבוהה יותר )עירור( עקב אנרגיה המתקבלת מפוטון אור; הירידה מהמצב המעורר מתבצעת תוך שחרור אנרגיית הפוטון בצורת חום. הבליעה החזקה ביותר היא של טריפטופן ,אחריו טירוזין ולבסוף פנילאלאנין .שאר חומצות האמינו אינן מגיבות עם האור בתחום זה .כאשר בוחנים חלבונים עשירים בחומצות האמינו הארומטיות ,ניתן לקבוע את ריכוז החלבון בתמיסה לפי הבליעה של החלבון בתחום 270ננומטר . • גופרית היא אינה חומר נפוץ במערכות ביולוגיות; יחד עם זאת ,שתיים מחומצות האמינו מכילות שיירים עם גופרית – ציסטאין ומתיונין ,כאשר בציסטאין אטום הגופרית נמצא בקצה ובמתיונין הוא נמצא בין פחמנים. בין ציסטאינים יכולים להיווצר קשרי S-S בתהליך חימצון ,בו משתחררים המימנים של ה- SHומתחברים לאטום חמצן )נוצרת מולקולת מים( ,וכך נוצר קשר .S-Sקשר זה הוא קשר קוולנטי המכונה קשר דיסולפידי והינו בעל תפקיד חשוב בייצוב חלבונים ויצירת המבנה שלהם. חמוטל בן דב החוג לביולוגיה ,אוניברסיטת תל אביב2011 , שיעור :02הקדמה לביוכימיה – פרק החלבונים – המשך 11 חומצות אמינו טעונות חיובית שלוש חומצות אמינו :ליזין ,ארגנין והיסטידין. חומצות אמינו אלו מכילות קבוצת אמינו בעלת מטען חיובי בערכי pHמסויימים .יחד עם זאת ,בהתאם לקבוע שיווי המשקל ,ישנם ערכי pHבהם שלוש חומצות האמינו האלו מאבדות את הפרוטון ומופיעות בצורה נייטרלית ללא מטען. בהיסטידין ,שחרור הפרוטון והמעבר בין הצורות הוא תהליך בשיווי משקל ,כאשר .pKa=6.0משום כך בערכי pHנייטרלים חומצות האמינו יהיו בעיקר לא טעונות ורק בערכי גבה חומציים הן תהיינה טעונות. לעומת זאת ,בליזין וארגנין ערך pKaהוא 10.5ו- 12.5בהתאמה .משום כך בסביבה נייטרלית הם תמיד יהיו במצבם הטעון. חומצות אמינות טעונות שלילית שתי חומצות אמינו :אספרטאט וגלוטאמאט. ערכי ה pKa-שלהן הם 3.9ו 4.1-בהתאמה, ולכן בסביבות נייטרליות הצורה שלהן תהיה הצורה הטעונה. בצורה זו תיארנו את עשרים השיירים של חומצות האמינו; כעת נעבור לתכונה אחרת של השיירים והיא ההידרופאטיות שלהם – תכונה המתארת את ה"רצון" או היכולת של חומצת האמינו להיות בסביבה מימית לעומת הידרופובית. החוג לביולוגיה ,אוניברסיטת תל אביב2011 , חמוטל בן דב ביוכימיה א' -שיעור 12 הידרופאטיות )(Hydropathy הטבלה הבאה מראה שלחומצות אמינו טעונות בעיקר וגם לחלק מחומצות האמינו הפולאריות יש ערכים שליליים למדי במדד ההידרופוביות ,בעוד שלחומצות האמינו האליפאטיות )לא פולאריות( יש ערכים גבוהים יחסית. הערכים האלה נמדדים כאשר מכניסים את החומר בתמיסה שיש בה פאזה אורגנית ופאזה מימית ,ומודדים את היחס בין החומר הנמצא בפאזה המימית לחומר הנמצא בפאזה האורגנית .ככל שהמספר חיובי יותר חומצת האמינו בעלת זיקה גבוהה יותר לחומר האורגני; ככל שהוא שלילי יותר הזיקה היא לתמיסה המימית. אמפוליטיות )(Amppolytes חומצות האמינו הן חלק ממולקולות המכונות צביטריונים ) ,(Zwitterionדו-פולאריות .אמפוליטיות היא תכונת הצביטריונים המתייחסת לשינוי שעוברת המולקולה בערכי pHשונים ,שינוי הנובע משתי הקבוצות הקיימות בכל החומצות אמינו – קבוצה קרבוקסילית וקבוצת אמינו. בערכי גבה נמוכים מ) pK1-המתייחס ל pK-של הקבוצה הקרבוקסילית( ,הקבוצה הקרבוקסילית אינה מיוננת אבל קבוצת האמינו כן מיוננת .זהו המצב ה ,Fully Protonated-והמטען של המולקולה הוא חיובי. חמוטל בן דב החוג לביולוגיה ,אוניברסיטת תל אביב2011 , שיעור :02הקדמה לביוכימיה – פרק החלבונים – המשך 13 כאשר מעלים את ה ,pH-מגיעים לערך ביניים שבין pK1ל) pK2-ערך ה pK-של קבוצת האמינו( ,מצב שבו ה pH-מספיק על מנת לינן את החומצה הקרבוקסילית אולם לא מספיק כדי להסיר את הפרוטון מקבוצת האמינו .כתוצאה מכך המצב הוא ,Half Protonatedוהמטען הכללי של המולקולה הוא .0 אם ממשיכים ומעלים את ה pH-מעבר לערך ה ,pK2-מגיעים למצב Fully Deprotonatedואז שתי הקבוצות חסרות פרוטון והמטען הכולל של המולקולה הוא שלילי.2 לחומרים מסוג זה ניתן לחשב – pIנקודה איזו-יונית שבה השדה החשמלי של המולקולה הוא ,0 והמולקולה לא מושפעת על ידי שדה חשמלי בו תהיה נתונה .ערכו ניתן על פי הנוסחה באיור הבא. נתון זה חשוב בחלבונים ,כי לרוב החלבונים יש מטען כולל כלשהו ובשל תכונת הדי-פולאריות ניתן לשנות את ה pH-ועל ידי כך להוריד את המטען של החלבון עד ל ,0-בנקודת .pI ככל שיורדים בריכוז הפרוטונים החלבונים מאבדים מטען; כאשר אין להם מטען החלבונים מאבדים את הדחייה הטבעית אחד מהשני )עקב מטענים שווים( ולכן יכולים להתקרב אחד לשני וליצור אגרגטים ,אשר שוקעים בתא .אגרגטים הם צבירי חלבונים שעשויים להיות אפילו טוקסיים אם הם מצטברים בתוך התא. כשאנחנו מדברים על חלבון ולא על חומצות אמינו ,אנחנו צריכים להתחשב בכך שאנחנו מפסיקים להתייחס לתכונות של קבוצה קרבוקסילית וקבוצת אמינו משום שביצירת שלד החלבון נוצר קשר בין הקבוצה הקרבוקסילית לקבוצת האמינו והן מאבדות את היכולת לאבד או לקלוט פרוטונים .כשאנחנו מדברים על pI של החלבון אנחנו מתייחסים רק לפרוטונים שנקשרים או מתנתקים מהשיירים הצדדיים. 2הערה" :המטען הכללי" אינו מתייחס למטען שניתן על ידי קבוצה .R החוג לביולוגיה ,אוניברסיטת תל אביב2011 , חמוטל בן דב 14 ביוכימיה א' -שיעור הטבלה הבאה מראה את ערכי ה pKa-של חומצות האמינו השונות .חומצות האמינו היחידות שש להן ערך pKaהן ציסטאין ,ליזין ,ארגנין ,היסטידין ,אספרטאט וגלוטאמאט; בעוד שציסטאין והיסטידין פחות מעניינות אותנו כי אין הרבה ציסטאין בתא וכי היסטידין לרוב נייטרלית ,שאר חומצות האמינו הן כאלה שנמצאות כמעט תמיד במצב המיונן שלהםן ומכילות מטענים שליליים או חיוביים ,בהתאם. חמוטל בן דב החוג לביולוגיה ,אוניברסיטת תל אביב2011 , שיעור :02המבנה התלת-מימדי של החלבון 15 שיעור :02המבנה התלת-מימדי של החלבון החלבונים הם פולימרים של חומצות אמינו; יש להם ארבע רמות ארגוניות: • מבנה ראשוני – רצף חומצות האמינו בתוך החלבון .אין התייחסות למבנה תלת מימדי ,אלא לסדרת האותיות או שמות חומצות האמינו הבונות את החלבון. • מבנה שניוני – מבנים מחזוריים בתוך החלבון .נכיר שלושה מבנים מרכזיים – סליל אלפא ,קפל בטא וסיבוב צפוף. • מבנה שלישוני – מבנה תלת מימדי מוגדר אליו מגיע החלבון בתלות בסביבה שלו – מימית או הידרופובית. • מבנה רבעוני – חלבונים שונים שמגיבים אחד עם השני ויוצרים מבנים גדולים ומורכבים .במבנה זה יכולים להשתתף אפילו עשרות חלבונים ליצירת הקומפלקס. המבנה הראשוני – רצף חומצות האמינו שלרצף חומצות האמינו יש כיווניות – חומצת האמינו הראשונה ברצף היא בעלת קבוצת אמינו חופשית וחומצת האמינו האחרונה בעלת קבוצה קרבוקסילית חופשית. כיווניות זו נובעת מכך שחומצת האמינו הראשונה יוצרת קשר אמידי בין הקרבוקסיל שלה לאמינו של חומצת האמינו השנייה; חומצת האמינו השנייה יכולה להתחבר הלאה רק דרך הקרבוקסיל ,ולכן הכיווניות נשמרת .חומצת האמינו האחרונה אינה יוצרת קשר עם חומצות אמינו אחרות ולכן הקרבוקסיל שלה פנוי; כמו כן חומצת האמינו שמתחילה את הרצף היא בעלת אמינו פנוי משום שהיא לא קשורה לחומצת אמינו קודמת. להזכירכם :החלבון הוא גדיל פולימר שנוצר על ידי הריבוזום; הסיבה שחומצות האמינו הראשונה והאחרונה הינן בעלות קצוות אמינו וקרבוקסיל חופשיים בהתאמה היא כי במהלך סינטזת החלבון ועריכתו הן נקבעו כראשונות ואחרונות ,ולכן לא באות ולא יבואו חומצות אמינו נוספות לפניהן או אחריהן ,בהתאמה. הקשר האמידי נובע מחיבור בין קרבוקסיל של חומצת אמינו אחת לאמינו של חומצת האמינו הבאה אחרי. תהליך יצירת הקשר דורש אנרגיה ,הנובעת מהידרוליזה של ) ATPהנצרך על ידי הריבוזום( – זהו לא תהליך ספונטני ,כלומר ערבוב של חומצות אמינו בפני עצמן לא יוביל ליצירה של פפטיד ובטח שלא ליצירה של חלבון. החוג לביולוגיה ,אוניברסיטת תל אביב2011 , חמוטל בן דב ביוכימיה א' -שיעור 16 מבנה רזוננטיבי של הקשר הפפטידי הקשר האמידי )פפטידי( מתקיים בין שני פחמני אלפא שביניהם יש פחמן קרבונילי וחנקן .הקשר הכפול לחמצן יכול לעבור ברזוננס לקשר בין הפחמן הקרבונילי לחנקן ,עובדה המייצבת את הקשר ומביאה לכך שהאלקטרון שייך בו זמנית לשלושת האטומים הקשורים ברזוננס. הטבע הפולארי של קשר פפטידי הפחמן הקרבונילי ,שיש לו רזוננס לקשר כפול עם החנקן ,הינו בעל היברידיזציה של SP2ולא SP3ולכן לא ניתן לסובב את המולקולה סביב הקשר הזה ,כי הוא נחשב לקשר כפול .מסיבה זו נוצרת יחידה קשיחה ופלאנארית המערבת את שלושת הפחמנים )שני פחמני אלפא ופחמן קרבונילי( ,החנקן עם המימן הקשור אליו והחמצן .המולקולה היא פלאנארית ,קשיחה ושני פחמני אלפא נמצאים בקונפורמציית מבנה טראנס – שניהם פונים לצדדים שונים. לא קיים מבנה ציס בחלבונים. אם מציגים את החלבון כולו ,הוא מכיל הרבה קשרים פפטידים ומתוקף כך יש הרבה מאוד מישורים פפטידיים; בין כל שני מישורים יש פחמן אלפא .את המישורים בינם לבין עצמם מותר לסובב סביב ציר של הקשרים שיוצר פחמן אלפא עם הפחמן הקרבונילי מחד והחנקן מאידך .יחד עם זאת יש לזכור כי את המישור עצמו – בתוכו – אסור לסובב .הזוויות שנוצרות בין המישור לקשר – זוויות פיי וקסיי – מספקות לנו מידע על המבנה של החלבון ,כי הן מאפשרות לנו לתאר את מבנה החלבון כפוקנציה של זוויות פיי וקסיי לאורך כל השרשרת הפפטידית. המדען שהמציא את התיאור של החלבון בעזרת הזוויות הוא Ramachandranוניתן לקרא על שיטתו בספר של לנינג'ר בעמודים .118-119 חמוטל בן דב החוג לביולוגיה ,אוניברסיטת תל אביב2011 , שיעור :02המבנה התלת-מימדי של החלבון 17 המבנה השניוני – סלילים וקפלים הכרנו יחידה פפטידית ,מישורית ,של מבנה ראשוני .היחידה מכילה חמצן ומימן )שקשור לחנקן( .המבנה השניוני נוצר עקב קשרי מימן הנוצרים בין חמצן )מקבל מימן( למימן אמידי )חנקן הוא תורם המימן( .שימו לב שהקבוצות הצדדיות אינן קשורות לייצוב מסוג זה. מבנה שניוני נוצר עקב קשרי מימן שנוצרים בין אטומי השלד של החלבון וללא כל השפעה או מעורבות של קבוצות צדדיות .R סליל אלפא מבנה זה נמצא על ידי המדענים לינוס פולינג ורוברט קורי ) (Linus Pauling & Robert Coreyב- .1951הסליל משלים סיבוב של 360°מדי אורך של 5.6אנגסטרם .הסלילים יכולים להיות בעלי ידניות מסויימת – הסלילים של החלבונים עולים נגד כיוון השעון ,ידניות יד ימין. הקשרים המייצבים את הסליל כאמור הם קשרי מימן בין האטומים של הקשר הפפטידי בלבד. החמצן של חומצת האמינו הראשונה ברצף יוצר קשר מימן עם החנקן ששיך לחומצת האמינו החמישית ברצף .באופן דומה חמצן מחומצת האמינו השנייה יוצר קשר עם החנקן מחומצת האמינו השישית ,וכן הלאה ) Oבעמדה nיוצר קשר עם חנקן בעמדה .(n+4 הערה :כפי שנראה בהמשך ,אומנם הקשרים האלה מתקיימים בלי שום תלות בשיירים Rאבל לשיירים אלו כן יש השפעה מבחינת העדפה לאיזה מבנה שניוני ליצור – אם בכלל. קבוצות צדדיות בסליל פונות כלפי חוץ בלבד .הקוטר הפנימי של שלד הפפטידים של הסליל הוא 5אנגסטרם ויחד עם השיירים זה 10אנגסטרם; הסיבה המרכזית והפשוטה לכך שהשיירים פונים החוצה היא שאין שם מקום אפילו לדחוס מולקולת מים. החוג לביולוגיה ,אוניברסיטת תל אביב2011 , חמוטל בן דב ביוכימיה א' -שיעור 18 שיעור :03רמות הארגון של החלבון מבנים שניוניים – המשך בשיעור שעבר דיברנו על המבנה הראשוני – הרצף הלינארי של חומצות האמינו בשרשרת הפפטידית, המתחילה במספורה מקצה Nועד קצה .Cהמבנה השניוני ,בו התחלנו לעסוק ,בנוי ממבנים מחזוריים בתוך השרשרת שנובעים מקשרי מימן בין האטומים המרכיבים את השלד ולא מערבים קשרים לשיירים צדדיים אלא רק יחידות פפטידיות – מישורים קשיחים של אטומים .קשרי המימן הם בין מימן של החנקן לחמצן הקרבוקסילי. המבנה הכי נפוץ הוא מבנה סליל אלפא ,המיוצב על ידי קשרי מימן בתוך הסליל בין חמצן של חומצת אמינו בעמדה nלמימן אמיני של חומצת אמינו בעמדה .n+4ארבע חומצות האמינו בהתחלה ובסוף יוצרות רק קשר מימן אחד ,כל השאר יוצרות שני קשרי מימן. גדילי בטא וקפלי בטא שרשרות פוליפפטידיות יוצרות גדילים קשיחים וישרים מאוד; המבנה הזה אינו יציב בפני עצמו ולכן יש קשרי מימן בין גדילי בטא שונים ,כך שהם יוצרים קפל בטא ).(beta sheet ההבדל העיקרי בין זה לסליל אלפא הוא שקשרי המימנים הם בין השרשרות ולא בתוך השרשרת עצמה וכן שאין בהכרח מרחקים קבועים בין המולקולות המעורבות בקשרים. היות ולרצף הלינארי יש כיווניות ,קפלי בטא יכולים להיות בעלי קונפורמציה מקבילה )הגדילים באותה כיווניות( או אנטי-מקבילה )כל שני גדילים סמוכים הם בכיווניות הפוכה( .קשרי המימן בקפל אנטי- מקביל הם ישרים ,לעומת קשרים בזווית שמתקיימים בקפל המקביל ,מה שמחזק את הקשרים בקונפורמציה ההאנטי-מקבילה. כל קבוצת פפטיד בקפל בטא מגיב עם שכניו בשני סוגי קשרים :המימנים של הגדיל מגיבים עם החמצן של השרשרת שנמצאת מעליו והחמצנים של הגדיל מגיבים עם המימן האמיני של הגדיל שנמצא תחתיו. באופן זה ניתן להוסיף עוד ועוד שרשרות פפטידיות לקפל. חמוטל בן דב החוג לביולוגיה ,אוניברסיטת תל אביב2011 , שיעור :03רמות הארגון של החלבון 19 קפלים מקבילים ואנטי-מקבילים המרחק בין חומצות האמינו בקפל האנטי-מקביל )עליון( הוא 3.47 אנגסטרם ובין שני גדילים שונים הוא 4.6אנגסטרם .השיירים של חומצות האמינו מתחלקים לכאלה שפניהם מעל המישור של הקפל וכאלה שפניהם תחתיו .ההבדל המרכזי בין מערכת מקבילה ואנטי-מקבילה )תחתון( הוא חומצות שהמרחק בין במערכת המקבילה הוא האמינו 3.25 אנגסטרם ,מה שאומר שהמבנה הזה פחות מתוח מהמבנה האנטי-מקביל. למעט זה אין הבדלים משמעותיים אחרים. איפיון מבנה הקפלים קפלי בטא הם מבנים מתוחים מאוד ,כמעט מישוריים ,והרבה פחות קומפקטיים מסלילי אלפא .משמעות הדבר היא שנכנסות יותר חומצות אמינו במבנה סליל אלפא – אותו המרחק שנבנה על ידי עשר חומצות אמינו בקפל בטא מכיל 23 חומצות אמינו בסליל אלפא ,כפי שרואים באילוסטרציה משמאל .קפל בטא יכול להכיל כמות רבה של חומצות אמינו בסך גדיליו ,אך לרוב הגדילים לא יהיו ארוכים במיוחד .ככל שיש לקפל בטא יותר גדילים כך הוא מכיל יותר קשרי מימן ועל כן עולה יציבותו. סיבוב צפוף אם רוצים לייצר קפלי בטא אנטי-מקבילים חייבים לסובב את השרשרת הפוליפפטידית .על מנת לפנות בין גדילים למצב מקביל או אנטי-מקביל השרשרת חייבת לעשות מעין "סיבוב פרסה" .הסיבוב הזה מכונה ) Beta-Turnסיבוב צפוף( .בצורה זו ניתן להביא את הגדיל הבא לאותו המקום כדי שיגיב עם הגדיל הראשון. במערכת של קפל מקביל אנחנו לא יכולים להשתמש בסיבוב צפוף ,כי הסיבוב הופך את כיוון הגדיל .לפיכך נוצר מבנה אחר ,גמיש יותר ,של לולאה ,שמוביל את הגדיל מקצה האחד לתחילתו על מנת שיקבילו. המבנה הזה יכול להיות גדול מאוד ולהכיל אפילו מאות חומצות אמינו. החוג לביולוגיה ,אוניברסיטת תל אביב2011 , חמוטל בן דב ביוכימיה א' -שיעור 20 איפיון הסיבוב הצפוף הסיבוב הצפוף מורכב מארבע חומצות אמינו המהוות מבנה שניוני בפני עצמן משום שהחמצן של חומצת האמינו הראשונה יוצר קשר מימן מהחומצה האמינית בעמדה הרביעית של הסיבוב הצפוף ) iו- .(i+3זהו מבנה שניוני מכיוון שהוא מקיים את התנאי של קשרי מימן בין חומצות אמינו על ידי אלמנטים של הפפטיד ולא על ידי שיירים .אלו תמיד 4חומצות אמינו בעלות סידור מיוחד ומסויים. השיירים והמבנה השניוני אנחנו לא עוסקים בתכונות של השיירים הצדדיים במבנה השניוני; יחד עם זאת ,יש לציין כי הקבוצות הצדדיות של חומצות אמינו שונות גורמות להעדפה למבנה שניוני כזה או אחר ,בהתאם לאינטראקציות בין חומצות האמינו. כך למשל ,חומצת האמינו הראשונה של הסיבוב הצפוף תהיה לרוב גליצין – בעל שייר קטן ולא נפחי המאפשר למולקולה להגיע לזוויות שחומצות אמינו אחרות אינן מגיעות אליהן, תודות לגמישותה הגבוהה .במבנים מחזוריים )אלפא או בטא( יש זוויות גדולות במבנה וגליצין משמשת לרוב לשבירת הזווית במבנה. בעמדה השנייה של הסיבוב הצפוף ,באופן הפוך ,לרוב תהיה פרולין כי הטבעת שהיא יוצרת בין קבוצת האמינו והשייר שלה מקבעת באופן יעיל את הזווית ,כך שהיא מייצבת את מצב סיבוב הפרסה. מסיבה זו ברוב המקרים סיבוב בטא מורכב מגליצין בעמדה הראשונה ופרולין בעמדה השנייה. עובדה זו אינה נכונה רק לפרולין ,גליצין והסיבוב הצפוף ,אלא לכל המבנים האחרים וחומצות האמינו האחרות; הטבלה הבאה מתארת את הזיקה של חומצות האמינו השונות להיות נתונות במבנה שניוני מסויים .המסומנות בכחול הן חומצות אמינו שכאשר הן במבנה הנתון הן נוטות לשבור אותו ,כי הזיקה שלהן חלשה מאוד לאותו המבנה. אין צורך לזכור את הזיקות; הגרף רק מדגים שלחומצות אמינו שונות עם שיירים שונים יש עדיפות למבנה שניוני כזה או אחר. חמוטל בן דב החוג לביולוגיה ,אוניברסיטת תל אביב2011 , שיעור :03רמות הארגון של החלבון 21 הטבלה משמאל מציגה את אותם הנתונים במספרים המתארים את הזיקה – ככל שהמספר גבוה יותר כן גבוהה הזיקה .שימו לה שאין עדיפות – 0כי תמיד יש סיכוי למצוא חומצת אמינו נתונה בכל אחד ממהמבנים ,הזיקה רק משנה את ההסתברות שזה יקרה. בתא יש חלבונים רבים; ישנם ביניהם כאלה שרוב המבנה השניוני הוא סליל אלפא ,אחרים שמורכבים ברובם מקפלי בטא .אנחנו יכולים לראות בגרף הבא חלבונים שונים ואת אחוזי סליל האלפא בחלבון. אלבומין )חלבון דם( או ציטוכרום סי )שרשרת הנשימה( עשויים כמעט רק מסליל אלפא; ככל שיורדים בגרף האחוז הולך וקטן, ובאופן נגדי אחוזי קפלי בטא עולים. חלבון ממוצע )באיור למטה( מכיל לרוב את שני המבנים ,ביחסים שונים. חשוב :הקשרים של המבנים השניוניים הם קשרים תוך-מולקולאריים ,שהם בתוך אותה השרשרת. יחד עם זאת מה שמאפיין את סליל אלפא הוא שהקשרים הפנימיים מתקיימים בתוך אותו הקטע במרווחים קבועים של ארבע חומצות אמינו ,בעוד שבקפל בטא הקשר בין שתי חומצות אמינו יכול להיות במרחק של 20חומצות אמינו או 200חומצות אמינו. החוג לביולוגיה ,אוניברסיטת תל אביב2011 , חמוטל בן דב ביוכימיה א' -שיעור 22 מבנה שלישוני – הקיפול המרחבי של החלבון ציינו את הרצף הלינארי והמבנים השניוניים של החלבון ,הנוצרים על ידי קשרי מימן שלא מערבים את השיירים של חומצות האמינו .המבנה השלישוני הוא המבנה התלת-מימדי המוגדר של החלבון ,בו אנחנו חייבים להתייחס לכל הכוחות – קשרים תוך-מולקולאריים בתוך החלבון וגם קשרים שהחלבון יוצר עם הסביבה. אמרנו שהסביבה היא גורם מרכזי בקביעת מבנה החלבון; אם נעביר חלבון מפאזה מימית לפאזה הידרופובית הוא יעבור דה-נטורציה ושינוי מבני שישנה את התכונות ,הקיפול והתפקוד הטבעיים שלו. ההגדרה "סביבה" היא כללית כי חלבון ציטוזולי יוצר קשרים עם סביבה מימית בעוד שחלבון ממברנלי יוצר קשרים הידרופוביים עם הסביבה הפנימית של הממברנה. הכוחות הפנימיים באיור הבא רואים אילוסטרציה של מבנה חלבון .אנחנו יכולים כבר לזהות מבנים שניוניים כמו סליל אלפא אבל אנחנו רואים גם מבנים חדשים ,למשל הקישור ליון מתכת הנכנס במיקום ספציפי ויוצר קשרים אלקטרוסטטיים עם שיירים טעונים או בעלי דיפול במבנה החלבון. בהמשך אנחנו רואים שתי חומצות אמינו סמוכות – וואלין ואיזולאוצין .שתי חומצות אלו הן הידרופוביות והן מגיבות אחת עם השנייה לפי האפקט ההידרופובי .אנחנו יכולים גם להבחין בקשרים די-סולפידים בין שיירים של ציסטאין ,קשרי מימן בין שיירים )במקום בין אטומי השלד( ,וכוחות משיכה הידרוסטיים בין שיירים טעונים במטענים הפוכים. • • • מגוון כוחות שונים – קשרי מימן ,אלקטרוסטטיים ,דיסולפידים וכוחות לא-פולאריים – פועלים בתוך החלבון עצמו לייצוב המבנה השניוני אבל גם קשורים לייצוב המבנה השלישוני שלו. הכוחות האלה משתתפים ביצירת המבנה התלת מימדי השלישוני של החלבון. הפולאריות של הקבוצות הצדדיות חשובה מאוד ליכולת שלהן להשפיע על הקשרים הפנימיים המייצרים את המבנה השלישוני שלו. חמוטל בן דב החוג לביולוגיה ,אוניברסיטת תל אביב2011 , שיעור :03רמות הארגון של החלבון 23 הכוחות החיצוניים הטבלה הבאה מראה את ערכי ההידרופוביות של השיירים של חומצות האמינו השונות. כשחלבון מתקפל בתמיסה מימית, למשל חלבון המיוגלובין ,3הדבר משפיע על צורתו המרחבית .באיור הימני רואים אילוסטרצית חתך עומק של החלבון; ניתן לראות את סידור חומצות האמינו לפי מד ההידרופוביות שלהן :כלפי חוץ פונים השיירים ההידרופילים השיירים וכלפי פנים ההידרופובים, פונים היוצרים סביבה הידרופובית פנימית. בקיפול חלבון המסיס במים ,שיירים צדדים על פני שטח החלבון יהיו בעלי יכולת תגובה עם מים – פולאריים ו/או טעונים .השיירים שפונים פנימה הם הידרופוביים ויוצרים פאזה הידרופובית נפרדת. אם היינו זורקים את מיוגלובין לסביבה הידרופובית ,הקיפול שלו ייתהפך – השיירים ההידרופובים ייפנו כלפי חוץ והשיירים ההידרופילים יידחו על ידי הסביבה וייצרו פאזה הידרופילית כלפי פנים החלבון. דוגמה זו מראה עד כמה התגובות של השיירים עם הסביבה משפיעות על הקיפול שלו. 3חלבון אלפא-סלילי ,שהמבנה הדומיננטי שלו הוא סלילי אלפא .החלבון הוא חלבון גלובולארי ,כדורי ,שנושא חמצן בשרירים )כמו המוגלובין( .יש לו קבוצה פרוסטטית של מתכת שקושרת את החמצן על מנת לשאת אותו. החוג לביולוגיה ,אוניברסיטת תל אביב2011 , חמוטל בן דב ביוכימיה א' -שיעור 24 החלבון הבא הוא ריבונוקליאז )אנזים שיודע לשבור .(RNAהמבנה המרכזי שלו הוא קפלי בטא .במבט צד ניתן להבחין בחומצות אמינו הידרופיליות על פני השטח ,ובחתך העומק רואים שהשיירים ההידרופובים פונים כלפי פנים. בצהוב מסומנים קשרים די-סולפידים ,סה"כ ארבעה קשרים המייצבים את החלבון .הייצוב שמעניקים קשרים אלה הרבה יותר גבוה משל קשרים אחרים מאחר ואלו קשרים קוולנטים .הימצאות של קשרים רבים כל כך מצביעה על כך שהמבנה של החלבון מיוצב מאוד. משמאל :מולקולות המים מסומנות בכחול ומגיבות עם השיירים הפולאריים הצדדיים המסומנים בירוק .הן יוצרות קשרי מימן עם הקבוצות הפולאריות ,ויוצרות מעין מעטה של מים על החלבון. באיור התחתון מופיע חלבון ממברנלי המורכב מארבעה סלילי אלפא שכל אחד מהם עובר בתוך הממברנה; ניתן לראות את סידור חומצות האמינו של הסלילים העוברים בתווך הממברנה ולכן כלפי חוץ פונים דווקא השיירים ההידרופוביים וכלפי פנים השיירים ההידרופיליים. חלבונים מסוג זה למשל יוצרים תעלות המספקות תווך מימי למעבר חומרים שהממברנה אינה חדירה להם. חמוטל בן דב החוג לביולוגיה ,אוניברסיטת תל אביב2011 , שיעור :03רמות הארגון של החלבון 25 האיור הבא מדגים חלבון עם מבנה סליל אלפא שהשיירים שלו פונים כלפי חוץ; סידור זה ,כפי שניתן לראות ,לא קורה רק באיזורים הלא-מסודרים של שרשרת החלבון אלא גם במבנים השניוניים, אשר גם בהם השיירים מסתדרים בצורה מסויימת – השיירים ההידרופילים של סליל האלפא באיור פונים מעלה לפאזה המימית והשיירים ההידרופובים פונים לתוך החלבון. התכונות הפיזיקליות של קיפול החלבון מבנהו השלישוני של החלבון נובע מהשיירים שלו ,כלומר ממבנהו הראשוני; לפי הנחה זו ,אם החלבון מכיל מספר חומצות אמינו בעלות רצף מסויים ואנו נזרוק את השרשרת לתוך מים ,היא תתקפל באופן מסויים אחד בלבד. תהליך זה אינו קורה בטבע ,כי ברגע שהחלבון מתחיל להיות מסונטז כבר יש מנגנונים שמתחילים לקפל אותו; אבל בניסוי ניתן לזרוק שרשרת דה- נטורטיבית לתוך המים ולבדוק זאת. ניסוי זה ,כשנעשה על ידי כריסטיאן אנפינסן ,הראה ששרשרות דה-נטורטיביות של חלבון מסוגלות להתקפל אפילו ללא כל סיוע חיצוני בחזרה לצורתן המקורית כל פעם מחדש. עובדה זו נובעת מהזיקות השונות של שיירים הידרופוביים ושל שיירים הידרופילים למים; רמות שונות אלו משמשות כוח מניע לקיפול מלא ונאטיבי של החלבון .עובדה זו – שרצף החלבון קובע את קיפולו – ברורה לנו היום אבל נקבעה בעקבות ניסוייו המדען האמריקאי כריסטיאן אנפינסן ).(Anfinsen לאנפינסן היה מזל גדול :כשזורקים שרשרת פפטיד למים ומשווים בין המבנה הזה למבנה של החלבון שנוצר בתא ,המבנים לרוב לא יהיו זהים משום שבתא פעילים שאפרונים וגם משום שהקיפול בתא לעולם לא נעשה במלואו על כל הרצף 98% .מהחלבונים נבדלים בקיפול במובן זה ,ואם אנפינסן היה משתמש באחד מהם הוא לא היה מגיע למסקנותיו; יחד עם זאת החלבון שבו הוא בחר ,ריבונוקליאז ,מצליח להתקפל גם כך וגם כך באותו האופן. החוג לביולוגיה ,אוניברסיטת תל אביב2011 , חמוטל בן דב ביוכימיה א' -שיעור 26 הניסוי של אנפינסן בריבונוקלאז ריבונוקליאז הוא חלבון שחותך גדילי .RNAיש לו מבנים של סליל אלפא וגם קשרים די-סולפידים בתוך החלבון. אנפינסון לקח חלבון פעיל ובדק את רמת הפעילות שלו; לאחר מכן העביר את החלבון לתמיסת אוריאה )(urea עם חומר מחזר )mercapto- ,(ethanolשיכול לחזר את הקשרים הדי-סולפידים ועל ידי כך לפתוח אותם. בצורה זו הוא ביצע דה-נאטורציה של החלבון .מולקולות האוריאה יוצרות קשרי מימן עם החלבון הדה-נאטיבי ועל ידי כך מתחרות בקשרי המימן שקיימים בסלילי אלפא ,עד לרמה שהן מפרקות אותם ופותחות את המבנה השניוני. לאחר שבירת המבנים השניוניים והקשרים הדי-סולפידיים של החלבון, מתקבל חלבון פתוח לחלוטין .במצב זה נמדדה הפעילות והייתה אפסית ,כיוון שהחלבון לא במבנה הפונקציונאלי שלו .בשלב זה ,אנפינסון סילק את האוראה ,הניח לחלבון שהות להתקפל ואז סילק את החומר המחזר וסיפק חמצן. בצורה זו אנפינסון ראה שהחלבון חוזר ל 100%-פעילות. המסקנה – הקיפול של החלבון הוא ספונטני בתמיסה ,ולכאורה נקבע על ידי רצף חומצות האמינו בלבד. כאשר ניסה להפוך את הסדר – קודם כל לסלק את החומר המחזר ורק אז את האוראה – לא התקבלה 100%פעילות חמוטל בן דב החוג לביולוגיה ,אוניברסיטת תל אביב2011 , שיעור :03רמות הארגון של החלבון 27 כי הציסטאינים יצרו קודם כל מיני קשרי די-סולפיד שונים ,וכתוצאה מכך המבנים נוצרים באופן אקראי ואינם מגיעים למצב המסודר שיכול להוביל ,בסילוק האוראה ,לקבלת מבנה מיוצב .יצירה של קשרים בסדר הלא-נכון אינה מאפשרת הפקה של חלבון פונקציונאלי. זיכרו :אמרנו שתהליך זה אינו קורה בתאים – החלבון המסונטז החדש יוצא כזנב קטן מתוך הריבוזום לפאזה המימית וכבר אז מתחיל להתקפל .כתוצאה מכך שהחלבון מתקפל כבר במהלך הסינטזה ,הוא מגיע לסידור ספציפי של חומצות אמינו הידרופוביות בפנים וחומצות אמינו הידרופיליות בחוץ ,וכל חומצת אמינו נוספת מצטרפת למבנה הקיים של הזנב .מסיבה זו רוב החלבונים לא יוכלו להתקפל באופן זהה לקיפולם בתאים בניסוי דוגמת זה שערך אנפינסן. החוג לביולוגיה ,אוניברסיטת תל אביב2011 , חמוטל בן דב ביוכימיה א' -שיעור 28 שיעור :04רמות הארגון של החלבון מבנה שלישוני – המשך שאפרונים מולקולאריים ציינו שהחלבון מתחיל להתקפל לתוך עצמו כבר עם היציאה שלו מתוך הריבוזום; יחד עם זאת ,הקיפול הספונטני של החלבון יכול להיות מעוכב ומווסת על ידי חלבונים המכונים שאפרונים מולקולארים .באיור משמאל ניתן לראות אותו החלבון שמתקפל ,במצב הראשון ,ללא שאפרונים ובמצב השני עם שאפרונים. השאפרונים מתיישבים על החלבון המסונטז ומונעים ממנו להתקפל ולהגיע למבנה התלת מימדי הספונטני שלו; כתוצאה מכך החלבון שנוצר ללא שאפרונים מורכב רובו מסלילי אלפא בעוד שעם השאפרונים מתאפשרת יצירה של קפלי בטא. בעזרת השאפרונים ניתן לכאורה לסנתז את כל השרשרת ולשמור עליה במצב דה-נאטורטיבי ואקראי ,וכאשר השאפרונים משתחררים החלבון מתקפל בפאזה המימית כמו שהיה עושה חלבון סינטטי. השאפרונים מעכבים את הקיפול ומאפשרים לשרשרת חומצות האמינו להגיע לקיפול הנכון והפעיל של החלבון .יחד עם זאת ,זוהי דוגמה קיצונית; המצבים השכיחים יותר הם אלו בהם החלבון מתחיל להתקפל ורק מקטעים מסויימים נותרים לא מקופלים בתיווך השאפרונים. ישנן מחלות רבות שקשורות בשאפרונים – אלצהיימר ,פרה משוגעת ,כמה סוגי סרטן – אשר גילו בהן קשר בין קיפול לא תקין של החלבון לבין המחלות .מכאן אנו יכולים להבין את חשיבותו הגבוהה של הקיפול הנכון. סוגי המבנה השלישוני של החלבון חלבונים יכולים להיות בעלי מספר צורות: • גלובולארים – כלפי פנים פונים שיירים הידרופובים ,כלפי חוץ שיירים פולאריים. חלבונים אלו לרוב מסיסים מאוד במים ומכילים הרבה סלילי אלפא. • פיברילות – חלבונים בצורת מקל )דוגמת קראטין( ,מקבלים צורה מאורכת ואינם מתקפלים לתוך עצמם כמו הגלובולארים .החלבונים האלה לרוב מתוחים ואינם מתמוססים היטב במים. • ממברנליים – חלבונים העוברים דרך הממברנה ,כאשר לרוב אם החלבון עובר מצד לצד המקטעים חוצי-הממברנה הם הידרופובים ומאופיינים בצורת סלילי אלפא. חמוטל בן דב החוג לביולוגיה ,אוניברסיטת תל אביב2011 , שיעור :04רמות הארגון של החלבון 29 חלבונים גלובולאריים המיוגלובין הוא דוגמה לחלבון גלובולארי ,כפי שכבר ראינו; ספציפית ,חלבון זה מכיל קבוצה מיוחדת המכונה קבוצה פרוסטטית – זוהי קבוצה אינטגרטיבית הקשורה בחוזקה לחלבון אולם היא אינה חומצת אמינו .במקרה של המיוגלובין ,קבוצה זו היא ה heme-ותפקידה לקשור חמצן ולהסיע אותו בתוך השריר. החלבון כדורי ומאוד הידרופילי. • חלבונים מסיסים במים ,צפופים ובעלי צורה כדורית. • הפנים של החלבון הידרופובי ופני השטח שלו מכוסים שיירים הידרופילים. • בין החלבונים הגלובולארים ניתן למנות אנזימים ונשאים שונים. חלבונים פיבריליים השערות שלנו עשויות בעיקר מחלבון הקראטין. קראטין הוא חלבון פיברילי היוצר צינורות ארוכים בתוך השערה .כתוצאה מכך השיער אינו מסיס במים, חזק מאוד ובהרבה מצבים אינו עובר שינוי או משנה את צורתו .תפקידו של החלבון הוא מכאני – כאבר חוש. • חלבונים המספקים תמיכה מכאנית ,בלתי מסיסים במים. • חלבונים ארוכים ,אשר לרוב מתקבצים יחד ליצירת כבלים ארוכים. סלסול קבוע – חלבוני הקראטין קשורים אחד לשני בקשרים דו-סולפידים המשווים למבנהם יתר חוזק. כאשר הולכים לעשות סלסול אצל ספר ,הספר משתמש בחומר מחזר הפותח את קשרי ה S-S-ועל ידי כך מוריד מהיציבות של השערה; לאחר עיצוב השיער בצורה מסויימת ,למשל הסלסול ,הספר מחמצן חזרה את הקשרים הדו-סולפידים וכך הצורה החדשה מתייצבת בחיזוק הקשרים הקוולנטים. החוג לביולוגיה ,אוניברסיטת תל אביב2011 , חמוטל בן דב ביוכימיה א' -שיעור 30 מבנה רבעוני – קומפלקסים אוליגומרים של חלבונים אם נחזור לדוגמה הקודמת ,אנחנו יכולים לראות שהמיקרופיבריל של הקראטין מורכבת למעשה ממבנה רבעוני – שלוש פיברילות של חלבון קראטין נקשרות בקשרים די-סולפידים ליצירת המבנה של המיקרופיבריל. מבנה רבעוני מורכב משתי תת-יחידות ומעלה – עד אלפי יחידות .תת היחידות יכולות להיות זהות )הומופולימר( או שונות )הטרופולימר( .ישנם מצבים של מספר תת יחידות זהות ומספר תת יחידות זהות מסוג אחר ,ואז המבנה מכונה הומו-הטרו-פולימר. הכוחות המחזיקים את החלבונים יחד הם קשרים שבעיקרם אינם קוולנטים – הידרופובים ,אלקטרוסטטים ,קשרי מימן – וגם קשרים די-סולפידים .ראינו את המיקרופיבריל העשויה קראטין ,ואנו יכולים להשתמש גם בדוגמת ההמוגלובין – נשא החמצן של הדם .חלבון זה הוא הומוהטרופולימטר ,עשוי שתי תת יחידות בטא זהות ועוד שתי תת יחידות אלפא זהות. במרכזו נמצאת מולקולת ה heme-שקושרת חמצן .המיוגלובין, הדומה לו ומצוי בשרירים ,אינו נחשב כבעל מבנה רבעוני כי הוא חלבון המורכב מיחידה אחת עצמאית בלבד )מונומר(. ייצוב המבנה הרבעוני הכוחות המייצבים את המבנה הרבעוני הם ,כפי שאמרנו ,כל הקשרים הלא-קוולנטים שציינו בעבר )קשרי מימן ,אלקטרוסטטיים ,די-סולפידים ,דיפול ואפקט הידרופובי( .יחד עם זאת ,להבדיל מהקשרים שראינו במבנים הקודמים ,התנאי להיותם קשר של המבנה הרבעוני הוא ששני האלמנטים של הקשר הבין- מולקולארי משתייכים לשני חלבונים נפרדים המהווים תת היחידות של הקומפלקס .בקשר מימן למשל, תורם המימן יהיה מחלבון אחד ומקבל המימן ישתייך לחלבון אחר. אלו אותם הכוחות המייצבים את המבנה השלישוני ,אולם שם הקשרים הם בתוך החלבוןעצמו ולא בין יחידות שונות. סיכום מבנה החלבונים • המבנה התל מימדי של החלבון נקבע לפי רצף חומצות האמינו של החלבון .זוהי מסקנתו של אנפינסן – רצף קובע קיפול. • השיירים של החלבון מגיבים עם הסביבה – הידרופובית בממברנה או הידרופילית בתוך התא – ותגובות אלו משפיעות ומכתיבות את המבנה שייתפוס החלבון. • הכוחות החשובים ביותר ליציבות החלבונים הם הכוחות החלשים – קשרי מימן ,קשרים יוניים וקשרי ון דר-ואלס .גם מבנה רבעוני וגם מבנה שלישוני מיוצבים על ידי קשרים אלו. חמוטל בן דב החוג לביולוגיה ,אוניברסיטת תל אביב2011 , שיעור :04קטליזה במערכות ביולוגיות – אנזימים 31 שיעור :04קטליזה במערכות ביולוגיות – אנזימים סיימנו את נושא מבנה החלבונים; כעת נתחיל לעסוק בתפקודים שלהם ,כאשר הראשונים בהם יהיו האנזימים – הזרזים של הביולוגיה .כל תגובה בגוף מזורזת על ידי חלבון אנזימטי המהווה קטליזטור של התגובה ומעלה את קצב הריאקציה בתוך התא .ישנן תגובות רבות בטבע; ביניהן איטיות ,ביניהן מהירות )באופן ספונטני( .אנזימים מסוגלים לזרז תגובות פי כמה סדרי גודל. מאפייני האנזימים • מזרזים תהליכים כימיים. • השמות של האנזימים בעלי סיומת .ase • הקידומת של השם מרמזת ,על פי רוב ,על תפקודו או הסובסטרט שלו – למשל פפטידאז הוא אנזים שמפרק פפטידים. • ניתן לחלק אותם לשש קבוצות לפי סוג התגובה שהם מזרזים )לא לפי גודל או תכונות מסיסות(. סוגי אנזימים • אוקסידו-רדוקטאזות ) – (Oxidoreductasesאנזימים שמטפלים בתהליכי חימצון/חיזור )קבלה/ מסירה של אלקטרונים( .בדוגמהAlcohol , Dehysdrogenaseמחמצן מולקולות אלכוהול ליצירת אלדהידים. • טראנספראזות )– (Transferases מטפלים בהעברת קבוצות ממולקולה אחת לאחרת .דוגמה לכך היא – Hexokinaseהמעביר פוספט ממולקולת ATPלגלוקוז. • הידרולאזות )– (Hydrolases מפרק קשרים קוולנטים על ידי מים בתהליך הידרוליזה .דוגמה לכך היא ,Arginaseאשר מפרק קשר קוולנטי בעזרת מולקולת מים וכתוצאה מכך משתחררת מהארגנין מולקולת אוראה. החוג לביולוגיה ,אוניברסיטת תל אביב2011 , חמוטל בן דב ביוכימיה א' -שיעור 32 • ליאזות )(Lyases – מורידה קבוצה מהמולקולה על מנת להותיר קשר כפול בין פחמן לחמצן או מוסיפות קבוצות לקשרים כפולים קיימים .הדוגמה היא ,Citrate Lyase אשר מפרק קשר בציטראט ליצירת קשר כפול לחמצן. • איזומראזות )(Isomerases – אחראים לאיזומריזציה של מולקולות – שינוי הסידור של הפנימי הקשרים במולקולה. Phosphoglycermutaseהוא אנזים היודע להעביר את קבוצת הפוספט של הפוספוגליצרול לחמצנים שונים במולקולה .גם בחומצות אמינו יש איזומרים – למשל ליאוצין ואיזוליאוצין – ומי שמזרז את שינוי הסידור של שתי חומצות האמינו האלו הן איזומראזות. • ליגאזות ) – (Ligasesמחברות יחד שתי מולקולות .דוגמה לכך היא ,Pyruvate carboxylase ההופכת פירובאט לאוקסאלואצטאט .אפשר גם להשתמש בדוגמת הליגאזות המחברות את מקטעי חומצות הגרעין אחד לשני )מחברות את מקטעי אוקאזאקי(. אנזימים מטפלים בקשרים קוולנטים! הקטליזה של האנזימים אין זה משנה באיזו תגובה נמצאים האנזימים ,הם עדיין חולקים יחד תכונות רבות: • האנזימים הם זרזים ובתור שכאלה אינם משתנים במהלך התגובה – האנזים נכנס ויוצא באותו המצב והמבנה. • האנזימים מאיצים תגובות ,מעלים את קצב הריאקציה בעשרות מונים ,אבל הם אינם משנים את קבוע שיווי המשקל .משמעות הדבר היא שהם יודעים לזרז את התגובה בשני הכיוונים באותה המידה. • האנזימים מסוגלים להעלות קצב ריאקציה תודות ליכולתם להוריד את אנרגיית האקטיבציה של הריאקציה. • האנזימים מאוד ספציפיים – אלפי תגובות מתחוללות בתא וכל אנזים מזרז תגובה מסויימת. חמוטל בן דב החוג לביולוגיה ,אוניברסיטת תל אביב2011 , שיעור :04קטליזה במערכות ביולוגיות – אנזימים 33 אנזימים מגבירים את קצב התגובה הכימית נניח תגובה בה המגיב Aהופך לתוצר ,Bונניח כי קיים שיווי משקל במעבר של המגיב Aלתוצר ,B כאשר בכל כיוון יש קבוע שיווי משקל מסויים. בדוגמה היחס בין שני קבועי המשקל כאשר הריאקציה אינה מזורזת הוא ,100כלומר התגובה הראשונה מהירה פי 100מהשנייה. כאשר מוסיפים אנזים ,האנזים מעלה את קצב הריאקציה ומעלה אותו ב 7-סדרי גודל – פי 10 מיליון .יחד עם זאת ,העלייה הזו שווה בשני קבועי שיווי המשקל – בשני הכיוונים של הריאקציה .עדות לכך ניתן לראות בכך שאם נחשב את היחס בין קבועי שיווי המשקל ,עדיין ייתקבל שהאחד גדול מהשני פי .100 האנזים מזרז את התגובה בכל כיוון באותו סדר גודל – הוא אינו יכול לזרז לכיוון אחד פי 100 ולכיוון השני פי .1000בצורה זו נשמר היחס בין קבועי שיווי המשקל ולכן אנו טוענים שהאנזימים אינם משנים את קבוע שיווי המשקל. מדוע הקצב מ A-ל B-אינו זהה לקצב מ B-ל ?A-ניתן להבין זאת מתוך גרף האנרגיה החופשית ואנרגיית האקטיבציה של התגובה .האנרגיה החופשית של הסובסטרט נמצאת במקום מסויים ,והתוצר נמצא במקום אחר .הסיבה שהתגובה ABאינה מתרחשת באופן ספונטני היא שיש אנרגיית אקטיבציה גבוהה .האנזים מוריד את אנרגיית האקטיבציה של מצב המעבר ,ולכן למולקולה קל יותר לבצע את המעבר. יחד עם זאת ,במצב שבו Bבעל אנרגיה חופשית נמוכה משל ,Aהמעבר מ B-ל A-תמיד יהיה בעל אנרגיית אקטיבציה גבוהה יותר מאשר המעבר מ A-ל) B-כי Bצריכה לגשר גם על הפרש האנרגיות בינה לבין A וגם על אנרגיית האקטיבציה( .מסיבה זו יש הבדל בקצבי הריאקציה ומסיבה זו גם פעולת האנזים אינה משנה את קבוע שיווי המשקל של התגובה – כי סדר הגודל יורד במידה שווה לשני הכיוונים. החוג לביולוגיה ,אוניברסיטת תל אביב2011 , חמוטל בן דב ביוכימיה א' -שיעור 34 נניח שיש לנו סובסטרט שבתגובה שלו צריך להתכופף ועקב הכיפוף שעוברת המולקולה היא יכולה להתפרק; התהליך הזה קורה אבל מאוד לאט כי הסיכוי שהוא ייקרה בטמפרטורות פיזיולוגיות נמוך מאוד. אם יהיה חלבון שיוכל לתפוס את הסובסטרט אבל לא יכול לקפל אותו ,אין פעילות אנזימטית בתגובה; לעומת זאת ,אם יהיה אנזים שייתפוס את הסובסטרט ואז באתר הקטליטי שלו הוא יהיה בעל צורה מתאימה ויפעיל כוחות שיאפשרו כיפוף של הסובסטרט ,האנזים למעשה עוזר למולקולה להתפרק – ועל ידי כך מביא יותר מולקולות סובסטרט למצב בו הן יכולות לעבור את התגובה, כלומר מגביר את קצב הריאקציה. האנזימים למעשה מייצבים את מצב המעבר ולכן הרבה יותר מולקולות יכולות להגיע אליו בדרכן לתוצר התגובה. סיכום • אנזימים יכולים להגביר את קצב התגובה. • אינם משנים תרמודינמית את התגובה ,רק מורידים את אנרגיית האקטיבציה. • ישנם אנזימים כה פעילים שמזרזים את הריאקציה ב 16-סדרי גודל. • כל עלייה בסדר גודל אחד היא ירידה ב 5.7-קילו-ג'אול באנרגיה של מצב המעבר. חמוטל בן דב החוג לביולוגיה ,אוניברסיטת תל אביב2011 , שיעור :05קטליזה במערכות ביולוגיות – המשך 35 שיעור :05קטליזה במערכות ביולוגיות – המשך כפי שאמרנו ,אנזימים מעלים את קצב הריאקציה פי עשרות מונים על ידי הורדת אנרגיית האקטיבציה של התהליך ,של מצב הביניים .כתוצאה מכך הם גם לא משנים את קבוע שיווי המשקל של התגובה .כמו כן אנזימים אינם משתנים כתוצאה מהשתתפותם בתגובה – מתוקף היותם זרזים ולא מגיבים. האתר הפעיל אנזים הוא מולקולה גדולה בעלת 300-400חומצות אמינו ,בעלת משקל מולקולארי שלעיתים מגיע גם למיליון דלתון .האתר הפעיל ,שם מתבצע תהליך הזירוז ,הוא אתר קטן ושאר החלבון נועד להחזיק את האתר הפעיל בצורה מסויימת. תהליך הפעילות באתר בתחילה ,האנזים תופס את הסובסטרט ומכניס אותו לאתר הפעיל .האתר הפעיל בנוי כך שהוא מייצב את מצב המעבר .במהלך הכנסת הסובסטרט ,ישנה הוצאת של מולקולות המים שמקיפות את הסובסטרט ,כי האתר הפעיל הוא מרחב צפוף שמספיק בדיוק לסובסטרט – ללא מולקולות המים שהקיפו אותו .בשלב הבא ,חומצות אמינו בעלות שיירים צדדיים מיוחדים באתר הפעיל מגיבות עם הסובסטרט לייצוב מצב המעבר .אלמנט נוסף שחשוב לזירוז הוא קבוצות פרוסטטיות 4 – שאינן שיירים של חומצות אמינו אבל הן חלק מהחלבון וקשורות אליו בקשרים קוולנטים או קשרים אחרים – אשר עוזרות לזירוז באתר הפעיל. התגובה בין האתר לסובסטרט ברגע שהמולקולה של הסובסטרט נכנסת לאתר הפעיל ,כמה מנגנונים יכולים לתאר את התגובה ביניהם: • מנעול ומפתח ) – (Lock and Keyהסובסטרט מתאים לאתר הפעיל כמו מפתח לחור מנעול ,התאמה מבנית מאוד טובה וספציפית .הצורה של הסובסטרט מאוד מתאימה לצורה של האתר הפעיל. ברגע שהסובסטרט נכנס ,חומצות אמינו באתר הפעיל יוצרות קשרים ומגיבות עם הסובסטרט על מנת לייצב את מצב המעבר .גם זווית הכניסה של הסובסטרט חשובה ,כמו זווית ההכנסה של מפתח למנעול ,והאנזים בוחר מצבים מסויימים של הסובסטרט אשר רק איתם הוא יוצר קומפלקס. 4לא נמצא בכל האנזימים והחלבונים. החוג לביולוגיה ,אוניברסיטת תל אביב2011 , חמוטל בן דב ביוכימיה א' -שיעור 36 • התאמה מושרית ) – (Induced Fitמבנה הסובסטרט לא תמיד מתאים במדוייק לאתר הפעיל; לכן במקרה זה יש יצירת קשר ראשוני של הסובסטרט ,פחות חזק מאשר במצב המנעול והמפתח ,אשר בעצם יצירתו גורם לשינוי קונפורמציה של צורת החלבון כך שלאחר השינוי האתר הפעיל המתקבל מתאים במדוייק לסובסטרט. משמאל :ניתן לראות המחשה להתאמה מושרית – כניסת הסובסטרט גלוקוז לאתר הפעיל של ההקסוקינאז משנה את המבנה שלו מהמבנה הכחול למבנה האדום ,כאשר למבנה האדום יש אתר פעיל שמתאים במדוייק לסובסטרט. תפקיד השיירים באתר הפעיל בנושא זה נעסוק באתר הפעיל של אנזים ספציפי – – Carboxypeptidase Aונראה מה תפקידם של השיירים בו ,כאשר התפקוד הזה מקביל גם באנזימים אחרים .מבחינת פעילות ,האנזים הזה יכול לחתוך שרשרות פפטידים בקצה הקרבוקסילי וליצור קרבוקסיל במקום הקשר .הייחודיות של הקצה הקרבוקסילי ,שלא כמו הקצה האמיני או שאר החלבון ,היא שיש שם מטען שלילי. האנזים פועל במנגנון של התאמה מושרית – המבנה שלו משתנה כאשר הסובסטרט נכנס לאתר הפעיל; הוא מייצב את הקומפלקס עם הסובסטרט ביצירת קשרים שונים וכן הוא מכיל קבוצה פרוסטטית מטאלית. שימו לב שבמקרה זה גם הסובסטרט וגם האנזים הם חלבונים. האנזים הוא חלבון גדול והאתר הפעיל הקטן שלו )מסומן אדום( נמצא במרכזו. יש לנו גם קבוצה פרוסטטית של אבץ וכן חומצות אמינו נוספות מסומנות )ראו באיור הבא(. חמוטל בן דב החוג לביולוגיה ,אוניברסיטת תל אביב2011 , שיעור :05קטליזה במערכות ביולוגיות – המשך 37 כניסה של הסובסטרט לאתר הפעיל גורמת לשינוי קונפורמציה – התאמה מושרית -שמקרבת את חומצות האמינו המסומנות ,החשובות לזירוז ,אל האתר הפעיל. האיור הבא מציג אילוסטרציה של האתר הפעיל והסובסטרט יחד. הסובסטרט הוא הקצה הקרבוקסילי של שרשרת פפטידית כלשהי הנכנסת לאתר הפעיל .הקבוצות המסומנות באנזים הן קבוצות שנמצאו כחשובות מאוד ושהחלפתן עקב מוטציות או במעבדה גורמת לאובדן הפונקציה של החלבון. הקבוצה הקרבוקסילית נושאת מטען שלילי; הארגנין יוצר קשר אלקטרוסטטי עם המטען השלילי ,שכן החנקן של הארגנין הינו בעל מטען חיובי .הקשר בין טירוזין לחנקן של השלד הפפטידי הוא קשר מימן ,והקשרים בין החומצה הגלוטמיט, הארגנין בעמדה 127והאבץ הוא קשרי מטען-דיפול. האבץ הוא יון בעלת דרגת ערכיות .+2בקבוצה הפרוסטטית ,הוא יוצר ארבעה קשרים עם חומצות האמינו שסביבו – חומצה גלוטמית בעמדה ,72היסטידין בעמדה 196והיסדטידין בעמדה .69הקשרים האלה מקובעים מאוד והקבוצה קשורה לחלבון באופן חזק מאוד. הקבוצה חשובה לזירוז ואם נרחיק אותה מהחלבון הוא יאבד פעילות. ארגנין 145וטירוזין 248יוצרות קשר יחיד כל אחת לסובסטרט ,הן מייצבות את מצב המעבר אבל אינן קשורות לתהליך הזירוז – תפקידן לקשור את הסובסטרט ולייצבו בלבד .השיירים אינם משתתפים בתהליך הזירוז עצמו. שלושת האלמנטים האחרים – חומצה גלוטמית ,270ארגנין 127ואבץ – מייצבים את הקומפלקס וגם שותפים בתהליך הזירוז .שלושת קבוצות אלו יוצרות קשרים עם פחמן הקרבוניל )והחמצן שלו( של חומצת האמינו האחרונה .כמו כן יש מולקולת מים קרובה לפחמן הקרבונילי. החוג לביולוגיה ,אוניברסיטת תל אביב2011 , חמוטל בן דב ביוכימיה א' -שיעור 38 הארגנין והאבץ מושכים בחוזקה את האלקטרון של הקשר בין הפחמן לחמצן ,ויחד עם הקשר ההפוך בין החומצה הגלוטאמית לפחמן המטען של האלקטרון הקשר נמרח בין חומצות האמינו .כתוצאה מכך הקשר נחלש ,ואנו מעלים את האנרגיה החופשית קרוב יותר למצב המעבר .המולקולה אינה יציבה ,ובשלב זה נכנסת מולקולת המים – אשר תוקפת את הקשר הפטטידי ושוברת אותו. אם היינו מחליפים את חומצת האמינו ארגנין 145בחומצת אמינו חיובית )מתוך הנחה שזה לא גורם לשינוי סטרוקטורלי משמעותי( ,לא היה קורה כלום; אם היינו מחליפים לגליצין למשל ,האפיניות של האתר הפעיל הייתה יורדת – כי גליצין לא יכולה לייצב את הסובסטרט .לעומת זאת אם נחליף את ארגנין 127בליזין אנחנו נאבד פעילות – כי הארגנין הזה קשור גם לתהליך הזירוז ובלעדיו ספציפית התהליך לא יתקיים. ספציפיות של משפחת האנזימים Ser-Protease ישנן מגוון משפחות של פרוטאזות, אנזימים שחותכים חלבונים; עד כה דיברנו על קרבוקסי-פפטידאז .אנזימים ממשפחת סר-פרוטאז חותכים את החלבון במרכזו ולא בקצה הקרבוקסילי. הטריפסין חותך את הקשר הפפטידי במקום בו יש ליזין או ארגנין – חומצות אמינו עם שיירים ארוכים בעלי מטען חיובי .המבנה של השייר הצדדי הוא ארוך וטעון חיובית ,והכיס של האתר הפעיל הוא עמוק – מתאים לכניסה של הליזין – ובתחתית הכיס יש קבוצה קרבוקסילית טעונה שלילית ששייכת לחומצה אספרטית באתר הפעיל ,היוצרת קשר מטען-מטען עם המטען החיובי של הליזין. טריפסין מאפשר כניסה של שיירים ארוכים עם מטען חיובי בקצה .הספציפיות של האנזים גבוהה מאוד :אם הייתה נכנסת חומצת אמינו עם שייר קצר הוא לא היה מגיע לקצה ,ואם לא היה מטען חיובי לא היה נוצר הקשר שמייצב את הסובסטרט. חמוטל בן דב החוג לביולוגיה ,אוניברסיטת תל אביב2011 , שיעור :05קטליזה במערכות ביולוגיות – המשך 39 כימוטריפסין יוצר קשר עם שיירים ארומטיים .זהו כיס פחות עמוק מהקודם אבל עדיין עמוק .בתחתיתו הוא לא פולרי ויש לו אפשרות ליצור קשרי טבעת לטבעת .מתאים לטריפטופן ,פנילאלאנין וטירוזין. שימו לב :חומצות אמינו אחרות בעלות שייר הידרופובי אולי גם עשויות להיחתך על ידי אתר פעיל זה ,אבל האפיניות שלהן מאוד נמוכה ולכן זה לא סביר .באנזימים האחרים בדוגמה יש ספציפיות הרבה יותר גבוהה, לעומת זאת ,ולכן אין כמעט סבירות כלל שהאנזים יחתוך במקום שאינו אמור. אלאסטאז חותך קשר פפטידי במקומות של אלאנין וגליצין – שהם בעלי השייר הצדדי הקטן ביותר שיש .הכיס מאוד לא עמוק ,כך שאם היו מנסות להתחבר קבוצות עם שייר צדדי גדול הוא פשוט לא היה מסוגל להיכנס לכיס. הספציפיות נובעת מטבע הכיס של האתר הפעיל והקבוצות המעורבות ביצירת הקומפלקס. קינטיקה אנזימטית בתגובה כימית קיים סדר ריאקציה :סדר הריאקציה קובע את מספר החומרים שריכוזם משפיע על קצב הריאקציה .איננו מתייחסים בדיון זה לחומרים ששותפים לתהליך אך ריכוזם אינו משפיע על הקצב. • סדר אפס – אף ריכוז אינו משפיע ,רק קבוע הקצב. • סדר ראשון – חומר אחד משפיע מבחינת ריכוזו. • סדר שני – שני חומרים משפיעים מבחינת ריכוזם וכן הלאה. בכימיה ,אין יצירה של קומפלקס בין המגיבים Aו ,B-ולכן יש תלות לינארית של מהירות התגובה בריכוזים של Aו) B-בהנחה שזה סדר שני( .לעומת זאת ,באנזימים ,יש יצירה של קומפלקס בין האנזים לסובסטרט .בתוך האתר הפעיל הסובסטרט משתנה והופך לתוצר)ים( ועוזב את האתר .זהו ההבדל בין תגובות כימיות וביולוגיות – יצירת קומפלקס בין אנזים לסובסטרט. עובדה זו בעלת השפעה על כי לתגובה האנזימטית יש כבר שלושה קבועי קצב ריאקציה :אחד של יצירת קומפלקס הסובסטרט-אנזים ) ,(k1אחד של התפרקות הקומפלקס ),(k-1 ואחד של יצירת התוצר ). (k2 קבוצות המייצבות את הקומפלקס משפיעות על הטייה לכיוון ESלעומת .E+S הקבוצות הפעילות באתר הפעיל משפיעות על מהירות המעבר מ ES-אל .E+P התלות של מהירות הריאקציה בריכוז הסובסטרט אינה לינארית כי אם פרבולית – עקום רוויה .ככל שנעלה את ריכוז הסובסטרט אנחנו נעלה את קצב הריאקציה אבל בשלב מסויים לא יהיה שינוי בקצב מכיוון שכל האנזימים יהיו תפוסים על ידי סובסטרט והקיבולת שלהם תגיע לשיא.5 5שימו לב :אנו מניחים שהאנזים קיים וריכוזו קבוע; תלות התגובה בריכוז האנזים היא לינארית. החוג לביולוגיה ,אוניברסיטת תל אביב2011 , חמוטל בן דב ביוכימיה א' -שיעור 40 אנזימים מזרזים תגובה לשני כיוונים ,ולכן שתי התגובות – יצירת הקומפלקס עם הסובסטרט ויצירת התוצר – הן תגובות הפיכות של שווי משקל ,כך שיש שני צדדים לריאקציה. קינטיקה אנזימטית – משוואות מכאליס-מנטן כשאנחנו מדברים על קינטיקה אנזימטית על ידי משוואות מיכאליס-מנטן ,יש לשים לב למספר הנחות החשובות לתיאור הזה: • התאור נובע מיצירת הקומפלקס ESבין האנזים לסובסטרט. • תאור הקצב בתלות בריכוז האנזים לסובסטרט ,מתחיל ממצב התחלתי אפס – שבו אין עדיין תוצר, כשרק שמנו את האנזים והסובסטרט יחד ולכן התגובה בכיוון ההפוך – – k-2אינה קיימת. • ריכוז האנזים הרבה יותר נמוך מריכוז הסובסטרט – בכמה סדרי גודל – ובכל נקודות המדידה שלנו. כתוצא מכך אנחנו יכולים לטעון שריכוז הסובסטרט יחסית קבוע . • קיים מצב יציב steady stateבמצב הקומפלקס .זהו אינו שיווי משקל שכן קיימת תגובה דינאמית. בתחילת התגובה אין קומפלקס ויש אנזימים חופשיים וסובסטרט; עם הזמן יורד ריכוז האנזים החופשי עד למינימום מסויים ועולה ריכוז הקומפלקס ,עד למצב יציב כלשהו ויחס קבוע בין הריכוזים .היחס הזה אינו משתנה למרות עלייה בכמות התוצר – כאשר לאחר הגעה למצב היציב הקצב של יצירת התוצר הופך לינארי. חמוטל בן דב החוג לביולוגיה ,אוניברסיטת תל אביב2011 , שיעור :06קינטיקה אנזימטית 41 שיעור :06קינטיקה אנזימטית ההבדל המרכזי בין זירוז אנזימטי ליצירת הקומפלקס הוא קבוע K1שאומר עד כמה יעיל תהליך יצירת הקומפלקס .כאשר האנזים מגיע למצב שהוא הופך מאנזים חופשי לאנזים בקומפלקס הוא עובר בין מצבים ,וריכוז האנזים הכולל שווה לריכוז האנזים החופשי ועוד ריכוז הקומפלקס ,המכיל את האנזים. משוואת מיכאליס-מנטן התיאור הפורמלי של משוואת מיכאליס מנטן כולל כמה הנחות: • התהליך מתחיל מריכוז התחלתי אפסי ) (0של התוצר. • ריכוז האנזים בכל המצבים נמוך משמעותית מהסובסטרט. • המערכת במצב יציב – שיווי משקל כך שריכוז ESאינו משתנה במהלך התגובה. אנחנו רוצים להציג את תלות המהירות או קצב הריאקציה בסובסטרט .יש את שלושת קבועי שיווי המשקל – -1 ,1ו – 2-שמאפיינים את התהליכים .קצב התגובה ניתן מהמשוואה הבאה: ) ,V0=k2[ES]=(k2[Et][S])/([S]+Kmכאשר ,Km=(k-1+k2)/k1 והוא קבוע מיכאליס מנטן .מהירות התגובה המקסימלית מתרחשת כאשר תנאי מיכאליס מנטן מתקיימים ואין יותר אנזים חופשי ואז המהירות שווה.Vmax=k2[Et] : בצורה כזו מגיעים למשוואת מיכאליס-מנטן המופיעה משמאל: משוואת מיכאליס מנטן מתארת את התלות של המהירות Vבריכוזו של הסובסטרט ].[S הגרף הבא מתאר את תלות המהירות בריכוז הסובסטרט. • בריכוזים מאוד נמוכים ,יותר נמוכים מ ,Km-ניתן להשמיט את ] [Sמהמכנה של המשוואה ולכן המשוואה מקבלת תלות לינארית בין המהירות לריכוז הסובסטרט. • בריכוזים מאוד גבוהים המהירות כבר אינה תלויה בריכוז כי מגיעים לרווייה של האנזימים הזמינים, ולכן המהירות שווה לקבוע שהוא המהירות המקסימלית. החוג לביולוגיה ,אוניברסיטת תל אביב2011 , חמוטל בן דב ביוכימיה א' -שיעור 42 כאשר המהירות שווה למחצית המהירות המירבית אנחנו מפתחים את המשוואה ומגיעים למצב בו ] .Km=[Sמשמעות הדבר היא שכאשר הריאקציה מתרחשת במהירות שערכה מחצית מVmax- אנחנו נמצאים בנקודה שבה ריכוז הסובסטרט שווה לקבוע מיכאליס מנטן. הבנת Km מה זה אומר לנו על האנזים? אם Kmנמוך ,זה אומר שהאנזים מגיע למחצית מהמהירות המירבית שלו בריכוזים נמוכים יחסית .משמעות הדבר היא שהאפיניות של האנזים גבוהה יותר לסובסטרט מאשר אנזים בעל Kmגבוה יותר. קבוע מיכאליס מנטן Kmהוא קבוע ביחידות מולאריות שערכו הוא ריכוז הסובסטרט במחצית המהירות המקסימלית .ככל שהוא נמוך יותר הזיקה של האנזים לסובסטרט גבוהה יותר. ישנם אנזימים מהירים ואיטיים – כאשר המהירים מזרזים תגובה באופן יעיל יותר מאיטיים ,ולאנזימים כאלה יש k2גבוה יותר מלאנזימים איטיים .אם מדובר באנזים מאוד איטי ,אפשר לבטל את האלמנט של k2מהמשוואה של Kmואז הערך הוא יחס .k-1/k1זוהי למעשה ההגדרה של קבוע שיווי המשקל של יצירת הקומפלקס ,ולכן .Km=Ks לעומת זאת ,באנזימים מאוד מהירים שבהם ,k2>>k-1אנחנו יכולים לדעת שה Km-יהיה הרבה יותר גבוה מקבוע שיווי המשקל אבל איננו יודעים בכמה. הבנת Vmax זהו קצב הריאקציה המקסימלי ,והוא שווה לקבוע שיווי המשקל כפול ריכוז האנזים הכולל .פרמטר זה לינארי בתלות בריכוז האנזים הכולל Vmax .מתאר לנו את האקטיביות של הזירוז עצמו – כמה פעמים אנזים אחד יודע להפוך את הסובסטרט לתוצר בשנייה .זהו קבוע קטליטי שלא מעיד על זיקה או אפיניות אלא רק על היעילות של הזירוז. חמוטל בן דב החוג לביולוגיה ,אוניברסיטת תל אביב2011 , שיעור :06קינטיקה אנזימטית 43 בקרבוקסיפפטידאז ,למשל ,המהירות הזו תתאר כמה מהר המים תוקפים את הקשר הפפטידי ומפרקים אותו. רוויה באתר הפעיל Kmאם כן ,מתאר את האפיניות; k2מתאר את קצב יצירת התוצר ולכן היעילות של האנזים .אם ריכוז הסובסטרט הרבה יותר נמוך מ Km-רוב המולקולות של האנזים אינן קשורות בסובסטרט ואז המהירות תלויה לינארית בריכוז הסובסטרט. כאשר שני אלמנטים אלו שווים המהירות היא מחצית מ ;Vmax-כאשר ריכוז הסובסטרט מאוד גבוה ,כל מולקולות האנזים מכילות סובסטרט וקצב הריאקציה שווה לקצב המקסימלי ונמצאים ברווייה. פיתוח לינוויבר-ברק נניח שאנו מודדים את קצב הריאקציה בריכוזי סובסטרט שונים; נמדוד את Vmaxואת .Kmמכיוון שקשה לעשות אנליזה טובה של הפרבולה שתראה מהו ה Km-המדוייק ,יש שיטה אחרת להפיכת קו הפרבולה לקו לינארי – פיתוח לינוויבר-ברק )Lineweaver- .(Burk Equationהפיתוח מתקבל כאשר הופכים את משוואת מיכאליס מנטן כאשר אנו מציבים את התלות של 1/Vבזו של ].1/[S הישר המתקבל ממשוואת לינוויבר-ברק חותך את ציר Xבנקודה בה 1/V=0 ובעזרת פיתוח אנחנו יכולים לקבל שערכה של הנקודה שווה ל .-1/Km-בחיתוך עם ציר Yמתקבל כי .1/V=1/Vmaxבעזרת ערכים אלו של הקו הלינארי אנחנו יכולים לחלץ את הערכים של Vmaxושל .Km החוג לביולוגיה ,אוניברסיטת תל אביב2011 , חמוטל בן דב ביוכימיה א' -שיעור 44 סיכום – מיכאליס מנטן הנתונים שלמדנו לחלץ מהמשוואות: • קבוע קטליטי המציין כמה מולקולות תוצר מייצר האנזים בשנייה. • – Kmשווה לקבוע שיווי המשקל כאשר k2<<<k-1בלבד. האנזים הממוצע הינו בעל קבוע קטיליטי של כ 50-מולקולות תוצר בשנייה ו Kmשל 10-4מולאר. • Vmaxשווה למכפלת קבוע יצירת התוצר בכמות האנזים הכוללת. • משוואת לינוויבר-ברק מספקת צורה אנאליזה נוחה. אנחנו עובבדים במצב עמיד ,שבו יש שיווי משקל בין צורת האנזים החופשי והאנזים בקומפלקס .בתלות בריכוז הסובסטרט ,היחס בין שני אלה שונה :אם יש יותר סובסטרט נוטים לכיוון הקומפלקס ,וההפך. הזירוז נעשה רק בקומפלקס ,ולכך כאשר ריכוז הסובסטרט שווה ל- ,Kmשמבטא את היחס בין שני תהליכי היצירה והפירוק של האנזים, הריכוזים של האנזים החופשי ושל האנזים בקומפלקס שווים ולכן קצב הריאקציה ,שהוא ערך קטיליטי ,שווה רק מחצית מערכו המירבי. עיכוב אנזימטי מעכבים יכולים לעכב את התגובות המזורזות של האנזים ועל ידי כך הם מורידים את קצב הריאקציה המזורזת .הם נדרשים למשל למיתון אברונים שמבצעים תגובות שמפיקות הרבה יותר מדי אנרגיה ,כי אם לא כן הדבר עלול להוביל לשריפה של התא; לכל אנזים יש מעכבים ותהליך זה חשוב מאוד כחלק מנגנון הרגולציות של התא. יש שני סוגים של עיכוב: • מעכבים תחרותיים – מתחרים עם הסובסטרט על כניסה לאתר הפעיל .האתר הפעיל יכול לקשור סובסטרט או מעכב ולכן אם האנזים תפס מעכב במקום סובסטרט ,האנזים מנוטרל – הוא לא יכול לשנות את המעכב ולכן הוא "סתום" מבחינת הסובסטרט. • מעכבים לא תחרותיים – באנזים יש שני אתרים ,אחד לאתר הפעיל שמטפל בסובסטרט ואחד הוא אתר של המעכב )אתר אלוסטרי(. כשנוצר קשר בין האנזים למעכב הוא מאבד את הפעילות האנזימטית. האתרים אינם תלויים ,ולכן האנזים יכול תמיד לקשור גם סובסטרט וגם מעכב – הם לא משנים את הזיקה של האנזים לחומר השני – אולם עצם הקשירה של המעכב מונעת פעילות אנזימטית ולכן הסובסטרט הנקשר לא יכול להפוך לתוצר. חמוטל בן דב החוג לביולוגיה ,אוניברסיטת תל אביב2011 , שיעור :06קינטיקה אנזימטית 45 אנחנו מדברים רק על מעכבים הפיכים .יש מעכבים לא-הפיכים ,שיוצרים קשר קוולנטי עם האנזים ונשארים שם תמיד .המעכבים שהזכרנו יוצרים קשרים חלשים דוגמת קשרי מימן ,לכן הם מעכבים הפיכים שניתן לשחרר מהאנזים. במעכבים תחרותיים ,החומר המעכב יוצר קשר עם אותו אתר פעיל של הסובסטרט ולכן המעכב יהיה מאוד דומה במבנה שלו לסובסטרט .מעכב של קרבוקסיפפטידאז ,למשל ,צריך להיות בעל מבנה דומה לקצה של הפפטיד – כאשר הוא נכנס לאתר הפעיל הוא סותם את האנזים אבל הוא גם יכול לצאת החוצה כי הוא מעכב תחרותי הפיך .היציאה שלו היא בשיווי משקל עם הכניסה, מכיוון שזו תגובה הפיכה. המעכב לרוב יצור קשרים דומים לקשרים שיוצר הסובסטרט באתר הפעיל. יחד עם זאת ,להבדיל מהסובסטרט, האנזים אינו יודע לשנות את המעכב ולכן המעכב נכנס ויוצא באותה הצורה. סיכום • המעכב הלא-תחרותי אינו משפיע על תכונות של האתר הפעיל לסובסטרט ,ולכן אינו משפיע על קצב יצירת קומפלקס עם הסובסטרט אבל הוא משפיע על קצב יצירת התוצר. • המעכב התחרותי משפיע על קצב הכניסה של הסובסטרט ליצירת הקומפלקס ,אולם מרגע שהסובסטרט נכנס אין הפרעה ליצירת תוצר ולכן אין השפעה על .k2 החוג לביולוגיה ,אוניברסיטת תל אביב2011 , חמוטל בן דב 46 ביוכימיה א' -שיעור הגרפים מראים מה קורה בנוכחות מעכב תחרותי ולא תחרותי מבחינת המשוואות של מיכאליס-מנטן ולינוויבר-ברק. במעכב תחרותי Kmמשתנה אבל המהירות המקסימלית אינה משתנה – אנחנו מגיעים לאותו קצב סופי פשוט בריכוזי סובסטרט יותר גבוהים .לעומת זאת במעכב לא תחרותי ה Km-אינו משתנה ,אולם המהירות המקסימלית המתקבלת נמוכה יותר. הסיבה שהוא לא משפיע על Kmהיא שתפיסת המעכב את האנזים אינה משפיעה על האפיניות לסובסטרט ,אלא רק גורמת לאיבוד הפעילות של האנזים ולכן מוציאה אנזימים מכלל פעולה ומורידה את כמות האנזימים הפעילים הכוללת. חמוטל בן דב החוג לביולוגיה ,אוניברסיטת תל אביב2011 , שיעור :06קינטיקה אנזימטית 47 קומפלקסים אנזימטיים -אוליגומרים עד כה עסקנו באנזים שעשוי ממונומר ,אין לו מבנה של קומפלקס אנזימטי ויש לו אתר פעיל אחד; במצב של קומפלקס אנזימטי ישנם מספר אתרים פעילים .אולם ,גם זה יכול לבוא בכמה מצבים .השיתופיות מתחילה כאשר יש אוליגומרים או לפחות דימרים, כאשר לשיתופיות כמה רמות: • אין שיתופיות – אין תקשורת בין המונומרים של האוליגומר ולכן קבועי שיווי המשקל זהים תמיד. • שיתופיות חיובית – לאתר הפעיל אין אפיניות גבוהה לסובסטרט ,אבל בריכוזים גבוהים הסובסטרט נכנס בכל זאת .עם כניסתו הוא גורם לשינוי מבני של כל האתרים הפעילים באוליגומר .בצורה זו כל האתרים הפעילים מקבלים אפיניות גבוהה יותר מאשר היו בתחילה ולכן כל קבועי שיווי המשקל הבאים קטנים יותר מקבוע שיווי המשקל הראשון. • שיתופיות שלילית – כאשר הסובסטרט נקשר לאחד האתרים הפעילים הוא גורם לשינוי מבני באתרים האחרים אולם הפעם השינוי מביא להקטנת האפיניות לסובסטרט ,דבר המקטין את היכולת שלהם לקשור סובסטרט .מסיבה זו קבועי שיווי המשקל הבאים גבוהים משל קבוע שיווי המשקל הראשון. הגרף מתאר את מספר האתרים התפוסים על ידי הסובסטרט כתלות בריכוז הסובסטרט. • כשאין שיתופיות אנחנו רואים קו פראבולי שמגיע בסוף לרווייה. • בשיתופיות חיובית יש קו זיגמואידלי כי צריך ריכוז התחלתי גבוה ,אבל ברגע שנכנס סובסטרט אחד השערים האחרים נפתחים. • בשיתופיות שלילית המולקולה הראשונה נכנסת באופן תקין אבל מורידהשל האפיניות וכך עוצרת את הכניסה כבר באתר הראשון. על מנגנון השיתופיות ניתן לקרא בספר של לנינג'ר בעמודים 162-172במהדורה הרביעית .על אנזימים עם כמה תת יחידות שניתן לעשות רגולציה בין היחידות – אלוסטרים – יש לקרא בעמודים .225-228 החוג לביולוגיה ,אוניברסיטת תל אביב2011 , חמוטל בן דב
