docמבוא לנוירוביולוגיה 100 אורי אשרי פרופ המרצה ` : ולכן מלחים צד אחד שלילי
download 
Report Transcription
מבוא לנוירוביולוגיה 100 אורי אשרי פרופ המרצה ` : ולכן מלחים צד אחד שלילי
מבוא לנוירוביולוגיה 100 המרצה :פרופ' אורי אשרי נושא :6יונים וזרמים מוליכים התאים מצויים בתמיסה מימית; המים הם מולקולה קוטבית – צד אחד שלילי יותר מהשני – ולכן מלחים המושרים במים מפורקים ליונים על ידיהם ומוקפים בשכבת הידרציה .בכיסוי שכבה זו נעים היונים בזרם הנוזלים בגוף. כל התאים עטופים בממברנה הידרופובית; מכאן שהיונים לא יכולים לחדור את הממברנה בדיפוזיה פשוטה .הממברנה מהווה מחסום בפני מעבר יונים חופשי .מעבר דרך הממברנה מתאפשר על ידי תעלות וטרנספורטרים. כאשר שמים תמיסת מלחים מצד אחד של ממברנה ,אין מתח אולם קיים הפרש ריכוזים .אם מכניסים לממברנה תעלות יתקיים מעבר יונים כתוצאה ממפל ריכוזים ,והתנועה תימשך עד להגעה לשיווי משקל – מצב בו אין מתחים וגם אין הפרשי ריכוזים. על מנת למדוד מתח של ממברנה בתא ,יש להשתמש בשתי אלקטרודות R :הינה נקודת הייחוס ו M-היא הממברנה .כאשר שתי האלקטרודות נמצאות באמבט הפרש המתחים בין האלקטרודות הוא ;0כאשר מכניסים את Mלתוך התא הנבדק ,מד המתח מראה ירידה במתח – המתקבע על ערך של כ.-60mV- הערך השלילי מראה שתוכן התא בעל ערך שלילי ביחס לחומר החוץ תאי .עובדה זו נכונה לגבי מרבית התאית והינה חיונית לחיוּת שלהם Vm .הינו מתח הממברנה ,והוא תמיד שווה למתח בפנים פחות המתח בחוץ .מאחר והמתח בחוץ הוא ,0המתח הפנימי שווה למתח הממברנה. חמוטל בן דב החוג לביולוגיה ,אוניברסיטת תל אביב2011-2012 , נושא :6יונים וזרמים מוליכים 101 אלקטרודה בקוטר של פחות ממיקרומטר חודרת לנוירון ,שקוטרו כ 10-מיקרומטר .מתח הממברנה במנוחה של נוירון הוא ,-65mVומתח זה חיוני לפעילות שלו .הפרה של המתח הזה תוביל למותו של התא. בתאים במערכת העצבים קיימת חלוקה לא שווה של יונים :תוך התא מכיל חלבונים וחומצות גרעין, בעלי מטען שלילי; הפיצוי על המטען הזה נעשה על ידי יוני אשלגן חיוביים – ולכן ריכוז האשלגן בתוך התאים גבוה מאוד לעומת ריכוזו החיצוני .בחלקו החיצוני של התא יש ריכוז אשלגן וריכוז אניונים נמוך )ומאוזן בינו לבין עצמו( ולכן אין הפרשי מתחים אולם קיים הפרש ריכוזים. פוטנציאל שיווי המשקל אם יתקינו תעלות בממברנה המפרידה בין המדורים ,אשלגן יתחיל לצאת החוצה; עקב היציאה שלו ,איזון המתחים שבמדורים יופר – המדור החיצוני יהפוך חיובי יותר והמדור הפנימי יהפוך שלילי יותר .ככל שיותר אשלגן ייצא ,המתח החיובי בחלק החיצוני ייגדל .בשלב מסויים המתח יהיה ברמה גבוהה דיה על מנת לדחות את מעבר האשלגן החוצה. בסופו של דבר הכוח הכימי המושך את האשלגן החוצה יישתווה לכוח החשמלי הדוחה אותו פנימה ,ונקודה זו היא פוטנציאל שיווי המשקל ) (E, equilibrium potentialבה הכוח המניע החשמלי שווה לכוח המניע הריכוזי .נקודה זו היא שיווי משקל שבה עדיין קיים הפרש מתחים .כתוצאה מכך נוצר Vm<0והפוטנציאל בחלקו הפנימי של התא שלילי יותר מזה שבמדור החיצוני .מכיוון שכך ניתן לומר שפוטנציאל שיווי המשקל של האשלגן הוא שלילי. יון הנתרן )ימין( גם הוא טעון חיובית אולם מוחזק ברובו במדור החיצוני; תוך התא מכיל מעט מאוד נתרן .28מטען הנתרן החיצוני מנוטרל על ידי אניונים ,כמו חלבונים או כלורידים ,ובפתיחת תעלת נתרן בממברנה המפרידה בין המדורים הקטיון מתחיל לזרום פנימה לאורך מפל הריכוזים; 28אחת הסיבות לכך ,ייתכן ,היא שמקור החיים היה במי הים המהווים סביבה עשירה בנתרן. החוג לביולוגיה ,אוניברסיטת תל אביב2011-2012 , חמוטל בן דב מבוא לנוירוביולוגיה 102 שוב נוצר הפרש מתחים עד לשיווי משקל – כשהכוח המניע הריכוזי ישתווה לכוח המניע החשמלי. בנקודה זו לא יהיו זרמים; אולם מכיוון שהנתרן מרוכז בעיקר בחוץ ,הוא יוצר פוטנציאל חיובי בתוך התא ופוטנציאל שלילי במדור החיצוני .פוטנציאל שיווי המשקל של יון הנתרן במערכת ביולוגית רגילה הוא תמיד חיובי. שני יונים מרכזיים אלו אחראים להביא את פוטנציאל שיווי המשקל למתח של .-65mV פוטנציאל שיווי המשקל הינו מצב בו הכוח החשמלי המניע שווה לכוח הריכוזי המניע .זהו המתח החשמלי הדרוש למנוע מעבר של היונים לצד השני עקב כוח מפל הריכוזים. ידיעת הריכוזים במדור הפנימי ובמדור החיצוני מאפשר לחשב את הכוח המניע הריכוזי ,ולכן ניתן לחשב את פוטנציאל שיווי המשקל של היון ,לפי משוואה שהוגדרה על ידי נרנסט. בטמפרטורה חדר של ,25°Cניתן להמיר את הנתונים לערכים מספריים קבועים ולכן פוטנציאל שיווי המשקל של יון שווה ללוגריתם היחסים בין החוץ לפנים כפול פקטור של 58mVוהערכיות )יון חיובי או שלילי(. יחס ריכוזי היונים מחוץ ובתוך התא הוא .10:140העלאת ריכוז היונים בחוץ תביא לדה-פולריזציה .עובדה זו משמשת במחקר על מנת לגרום לאקטיבציה של נוירונים. כיצד נקבע פוטנציאל הממברנה? במרבית תאי הגליה ישנן תעלות אשלגן הקובעות את פוטנציאל הממברנה של התאים ,ולכן פוטנציאל שיווי המשקל שלהם הוא כ .-70mV-תא תיאורטי שיש בו רק תעלות נתרן ,יהיה לו פוטנציאל שיווי משקל של כ .+50mV-אם קיימים שני סוגי התעלות במידה המאפשרת חדירות שווה של שני היונים, פוטנציאל שיווי המשקל יהיה .-10mV חמוטל בן דב החוג לביולוגיה ,אוניברסיטת תל אביב2011-2012 , נושא :6יונים וזרמים מוליכים 103 על מנת לשמר פוטנציאל ממברנה של ,-65mVכמו בנוירון ,יש להגדיל את חדירות האשלגן לעומת חדירות הנתרן .מסיבה זו ,היחס בין תעלות האשלגן לנתרן במערכת העצבים הוא 25:1לטובת תעלות האשלגן. המשוואה של גולדמן ,הודג'קין וכץ מחשבת את מתח הממברנה תוך התחשבות ביחסי החדירויות ובריכוזי היונים המשפיעים על המתח – נתרן ,אשלגן וכלור )למרות שהתרומה של כלור יחסית קטנה ולרוב מזניחים אותה( .האניונים אינם משחקים תפקיד מאחר ואינם חדירים – מעצם היותם חלבונים וחומצות גרעין. הנוסחה של גולדמן ,הודג'קין וכץ מבוססת על נרנסט אולם משקללת גם את יחס החדירויות בין היונים. כיצד שומרים על מתח הממברנה קבוע? במערכת מלאכותית תתקיים דיפוזיה של יונים עד שבסופו של דבר יאבדו מפל הריכוזים והפוטנציאל החשמלי .המערכת הביולוגית מונעת תהליך זה על ידי משאבות :Na/Kמשאבה זו הינה משאבה אלקטרוגנית המעבירה 3יוני נתרן החוצה תוך שהיא מכניסה 2יוני אשלגן פנימה .עקב כך היא לא רק מונעת את הדיפוזיה הטבעית ,אלא גם יוצרת מפל ריכוזים המחזק את המטען השלילי של הממברנה. המשאבה יוצרת היפרפולריזציה .29אם פעולת המשאבה תיפסק ,ריכוזי היונים יישתוו והפוטנציאל יהפוך פחות שלילי )יעבור דה-פולריזציה(. הרכיב ,Oubainהנמצא בהרדוף הנחלים ,מפסיק את פעילות המשאבה האלקטרוגנית ,ופוטנציאל המנוחה של התא עובר דה-פולרזציה. התא מכיל רכיבים שונים על גבי הממברנה :תעלות לשחלוף יונים ,טרנספורטרים השומרים על מפל ריכוזים וכדומה .ה Vm-של הממברנה מייצג מצב אמיד ולא שיווי משקל – מצב שצריך להשקיע כל הזמן אנרגיה על מנת לייצב אותו. מבנה גיבוש של תעלת אשלגן .הנקודה הסגולה הינה קריסטל אשלגן החודר דרך התעלה .כל גודלה מספר ננומטרים בודדים .ניתן לראות את גוף התעלה ושלוחות צדדיות שונות. 29היפרפולריזציה = כל מה שלוקח את ממברנת התא למתח שלילי יותר; המצב ההפוך מכונה דה-פולריזציה. החוג לביולוגיה ,אוניברסיטת תל אביב2011-2012 , חמוטל בן דב מבוא לנוירוביולוגיה 104 נושא :7תעלות וטרנספורטרים טרנספורטרים )משאבות ,נשאים( תעלות מעבירות 102-105יונים לשנייה .שימושיות מוליכות מספר עצום של יונים – 106-108 להעברת כנגד מפל ריכוזים ,על מנת לשמר מצב יונים/שנייה .פוטנציאל שימושי בשינוי ריכוזים אמיד. מהיר )(500V/sec תלוי אנרגיה )על פי רוב( ,דוגמת ATPאו כוח פעולה פאסיבית – לרוב תודות למפל ריכוזים מפל ריכוזים של קטיון )נתרן(. שנוצר בכוח שימוש באנרגיה. תעלות לרוב מתוארות כבעלות שער יחיד )פתוח/סגור(; המעבר דרכן ,מרגע שנפתחו ,יכול להיות דו- כיווני .טרנספורטר לעומת זאת מתואר כבעל שני שערים ודורש יותר שינויים מבניים במהלך הפעילות. המעבר ,עם זאת ,יכול להישמר בצורה חד-כיוונית עבור כל יון שעובר. תכונות התעלות • מוליכות – היכולת להעביר חלקיקים דרכן. • סלקטיביות וספציפיות – העברת חלקיקים מסויימים בלבד. • שוערות – אקטיבציה בהתאם למצב מסויים ,על ידי גורמים שונים )שינוי מתח ,קישור ליגנד וכו'(. • אינאקטיבציה – הפסקת הפעילות בהתאם לשינוי ,כמו האקטיבציה המופעלת בשינוי אחר. אפיון התעלה נעשה על ידי מדידת הזרם העובר בתעלה וכן על ידי טכניקות פרמקולוגיות הספציפיות לתעלות מסוג כזה או אחר. חמוטל בן דב החוג לביולוגיה ,אוניברסיטת תל אביב2011-2012 , נושא :7תעלות וטרנספורטרים 105 תעלות תלויות מתח במשפחת תעלות אלו נמנות תעלות יוני הסידן ,הנתרן והאשלגן. האיורים הבאים מדגימים מבנה של תת היחידה αבתעלת הנתרן .למעט תת היחידה αלכל תעלה יש תתי יחידות נוספות ) (β & γהמבקרות את היכולת של αלהעביר זרם – הן האחראיות לשוערות ולמוליכות של התעלה .לכל סוג תעלה יכולות להיות יחידות β & γשונות ,המבקרות את פעילותה באופנים שונים. התעלה הינה חלבון גדול מאוד; בחינת רצף חומצות האמינו מראה שהתעלה מעוגנת בממברנה על ידי מספר דומיינים ) (domainsשחוזרים על עצמם ) .(I-IVבכל אחד מהדומיינים יש סגמנטים )(segments הידרופובים טרנס-ממברנלים שיכולים לחצות את הממברנה .כמו כן ,בין סגמנטים 5-6יש אלמנט בשם P-loopהחודר לתוך הממברנה והוא זה המאפשר מעבר של יונים. כל אחד מהדומיינים יכולים להתקפל לצורת גליל; כאשר סוגרים את הגלילים הגדולים אחד ליד השני הם יוצרים מרווח ) (poreהמאפשר חדירה של היון. ברגע שארבעת הגלילים נסגרים ,ה p-loops-שלהם ממוקמות באיזור הפנימי של התעלה והיון מוכוון לאיזור זה. אבולוציונית ,כל תעלות היונים תלויות המתח דומות זו לזו והן כולן התפתחו מתעלת האשלגן .בבחינת תעלת הנתרן לעומת תעלת הסידן ,ההבדלים נובעים משינויים בחומצות אמינו ,ב P-loop-או באיזורים אחרים .ישנם גם הבדלים בלולאות הציטופלזמטיות ובקצות ה .N-terminus-ללולאות יש תפקיד חשוב בבקרה על פעילות התעלה – בין אם בשוערות ובין אם בזירוז הפעילות. מבחינת השימור האבולוציוני ,ישנן מספר תעלות נתרן שמספיקים שינויים בשתי חומצות אמינו על מנת לשנות את הסלקטיביות שלהן מנתרן לסידן .מחלות רבות במערכת העצבים נובעות ממוטציות שלא מאפשרות פעילות תקינה של השריר או העצב. החוג לביולוגיה ,אוניברסיטת תל אביב2011-2012 , חמוטל בן דב 106 מבוא לנוירוביולוגיה תעלת האשלגן נראית כמו דומיין בודד של תעלת נתרן או סידן; אולם בפועל ארבע תת יחידות כאלה יוצרות יחד את התעלה – הן פשוט אינן בעלות חיבור פיזי בין הדומיינים .מסיבה זו קיימת יותר וריאביליות של תעלות האשלגן – חיבור דומיינים שונים יכול ליצור תעלות אשלגן בעלות תכונות שונות. בכל אחד מהסגמנטים הטרנסממברנלים קיים סגמנט ,4המהווה חיישן המתח של התעלה – כל התעלות הנ"ל הן תעלות תלויות מתח ולכן פעילותן תלויה בשינוי מתח הממברנה .הסגמנט הזה יהיה בעל חומצות אמינו טעונות; שינוי מתח בממברנה ייגרום לשינוי בדחייה או במשיכה של הסגמנט הזה ,וכך הוא יוכל להרגיש את המתח .אולם ,הסגמנט גם צריך להיות טרנסממברנלי – כלומר הידרופובי. חמוטל בן דב החוג לביולוגיה ,אוניברסיטת תל אביב2011-2012 , נושא :7תעלות וטרנספורטרים 107 מוליכות בשנות ה 80-פיתחו ארווין נהר וברט סקמן את ה :Patch Clamp technique-מיקרואלקטרודה דקיקה מובאת אל ממברנת התא ושואבת קטע קטן ממנה .אם בקטע הממברנה הייתה תעלה ,ניתן יהיה להראות זרמים פנימה או החוצה .את המיקרואלקטרודה ניתן לחבר למד-זרם מאוד רגיש שימדוד את הזרמים העוברים בתעלה. Patch-Clampשתפס תעלת נתרן תלויית מתח .במתחים שהתעלה לא רגישה אליהם ,אין זרם .אם מעבירים דרך המיקרואלקטרודה מתח מתאים ,ניתן לגרום לדה-פולירזציה ולראות עלייה בזרם העובר בתעלה למשך מספר מילישניות .לאחר מכן ממשיכים שלא לקבל זרם )למרות ששינוי המתח נותר(. אולם מה ייקבע את גודל הזרם? ומה ייקבע את כיוונו? שני גורמים חשובים לתשובה זו: • מוליכות – מושפעת על ידי מספר התעלות. • הפרש מתחים – משפיע על קצב הזרימה על ידי מפל ריכוזים. הזרם )הנמדד ביחידות מיליאמפר (mA ,שווה לכוח המניע האלקטרוכימי כפול המוליכות. החוג לביולוגיה ,אוניברסיטת תל אביב2011-2012 , חמוטל בן דב מבוא לנוירוביולוגיה 108 כאשר יון חיובי זורם פנימה לתא ,שבו יש סביבה שלילית ,הזרם של היון פנימה הינו זרם שלילי. כאשר יון חיובי זורם החוצה מהתא ,הזרם הינו חיובי. אם המתח ישתנה למתח חיובי ,למשל מ-10mV- ל ,+10mV-יתקבל דווקא זרם חיובי שיוצא החוצה. אם מניחים את הנקודות שהתקבלו ביחסי הזרם והמתח על גבי מערכת צירים ,מתקבל גרף לינארי עולה המכונה ) IV Curveעקומת זרם/מתח(. תעלת הגרמיצידין 30 יכולה להיות באחד משני מצבים :סגור )קונפורמציה שלא מאפשרת מעבר יונים( או פתוח )קונפורמציה המאפשרת זרימת יונים והזרם הנוצר הוא זרם חיובי ,של יונים החוצה(. ביטאו תעלה כזו בתא שקל לבצע בו Patchוביצעו Patch- .Clampכעת ניתן לשנות מתחים משני צידי ה Patch-ולמדוד את הזרם .בעזרת הנתונים יצרו עקומת זרם/מתח שהופיעה כלינארית. עקומת מתח לינארית מאפיינת תעלה פאסיבית שאינה תלויית מתח. השינויים בין המתחים ככל הנראה לא נובעים משינוי במוליכות של התעלה )וצריך לוודא שזה אכן המקרה( ,אלא בשל שינוי בזרם ,הנובע רק מהכוח המניע האלקטרוכימי. 30ה Gramicidin-הוא חומר המופק מפטריות ומשמש להן כמנגנון הגנה המחורר דפנות חיידקים והורג אותם ,מעין אנטיביוטיקה הפועלת כתעלה. חמוטל בן דב החוג לביולוגיה ,אוניברסיטת תל אביב2011-2012 , נושא :7תעלות וטרנספורטרים 109 עקומת הזרם/מתח יכולה ללמד מספר דברים בנוגע לתעלה: • מוליכות – השיפוע של העקומה = מוליכות התעלה ,כפי שנגזר ממשוואת הזרם .ככל שהמוליכות גדולה יותר ,כן השיפוע גדול יותר. • נקודת ההיפוך ) – (Reversal Potwntialהנקודה בה הזרם משנה את כיוונו .מתחים שליליים מנקודה זו מובילים לזרם שלילי; מתחים חיוביים מובילים לזרם חיובי .המתח של הנקודה הוא פוטנציאל ההיפוך של התעלה. מכיוון שלתעלת אשלגן פוטנציאל ההיפוך יהיה פוטנציאל שיווי המשקל ) ,(-70mVניתן להבין שהתעלה אינה מוליכה רק אשלגן; אם הייתה תעלת נתרן ,פוטנציאל ההיפוך הוא .+50mVמכאן שהתעלה מוליכה כמה יונים – גרמיצידין יוצרת חור בממברנה ומאפשרת מעבר לא-סלקטיבי של יונים. מהם היונים הזורמים דרך התעלה? לא ניתן להסיק מסקנה זו בוודאות מהניסוי שלעיל; על מנת לבדוק את היונים העוברים אפשר לשנות את ריכוזי היונים בחוץ ובתוך המערכת – בהם אנו שולטים לחלוטין. אפשר להכניס למערכת יון אחד ספציפי ולבדוק את תגובת התעלה ליון – אם אין זרם ,הרי שהיון לא עובר דרך התעלה. אשלגן נמצא בריכוז גבוה בתוך התא ובריכוז נמוך מחוצה לו; פוטנציאל שיווי המשקל שלו הוא - 70mVולכן בפוטנציאל זה לא יהיה זרם יונים דרך התעלה .הסטה של מתח הממברנה שמאלה או ימינה מנקודה זו צריכה להתהפך מבחינת כיוון הזרימה – במתחים חיוביים יותר מפוטנציאל ההיפוך הזרם הוא החוצה ,במתחים שליליים הזרם הוא פנימה. נתרן מרוכז מאוד בחוץ וריכוזו נמוך בתוך התא; פוטנציאל ההיפוך שלו הוא .+50mVברגע שהמתחים יהיו שליליים מפוטנציאל שיווי המשקל )> (+50mVנתרן ייכנס פנימה .אם יהיה חיובי יותר )< (+50mVתתרחש תנועה של נתרן החוצה. השפעת הריכוזים עצמם של היונים מתבטאת בפוטנציאל שיווי המשקל – בנקודת ה 0-של הגרף. מכאן שהפרש המתחים ∆Vכולל בתוכו את כל מפל הריכוזים – הכימי והחשמלי – ולכן הוא מכונה הכוח האלקטרוכימי. החוג לביולוגיה ,אוניברסיטת תל אביב2011-2012 , חמוטל בן דב מבוא לנוירוביולוגיה 110 • מתח הממברנה = פוטנציאל שיווי המשקל ,אין זרם ואין מתח. • מתח הממברנה < פוטנציאל שיווי המשקל ,יוני האשלגן יוצאים החוצה – הזרם והמתח חיוביים. • מתח הממברנה > פוטנציאל שיווי המשקל ,היונים נכנסים פנימה ,הזרם והמתח שליליים. הממברנה הבאה מכילה תעלות אשלגן בלבד. פוטנציאל המנוחה של התא יהיה .-70mVיוני האשלגן נמצאים בשיווי משקל ויוני הנתרן אינם מרגישים את המערכת כי אינם משתתפים בה. ברגע שתיפתח תעלת נתרן המערכת תוסיף את הנתרן כמשתתף והמפל הכימי החזק לצד השליליות של תוך התא יביאו לכוח מניע גדול מאוד לכניסה של נתרן .יחד עם זאת ,למרות הכוח המניע הגדול המוליכות נמוכה – כי יש רק תעלה אחת. עם זאת ,מתח הממברנה עולה ,שכן בעקבות כניסת הנתרן התחוללה דה-פולריזציה .עכשיו מתח הממברנה שואף להגיע ל +50mV-ויוני האשלגן שבתוך התא מרגישים כוח אלקטרוכימי מניע שדוחף אותם החוצה .בהתאם ליחס בין תעלות הנתרן לאשלגן ,בשלב כלשהו זרמי האשלגן החוצה ישתוו בדיוק לזרמי הנתרן פנימה .כאן מתח הממברנה מתייצב על ערך חדש – שיהיה חיובי יותר ממתח המנוחה עם תעלות אשלגן בלבד .שימו לב שלמרות שהזרמים שווים בנקודה הזו ,הכוחות המניעים שונים :הכוח המניע של אשלגן קטן אבל יש לו הרבה מאוד תעלות; לנתרן יש כוח מניע חזק מאוד אבל מספר התעלות נמוך. בעקבות תהליך זה המערכת הגיעה ממצב של שיווי משקל למצב אמיד ) .(Steady Stateאם נותיר למערכת לרוץ לאורך זמן ,היא תגיע לאיפוס והמתח יאבד; מסיבה זו טרנספורטרים כמו נתרן/אשלגן חשובים לשמור על המצב האמיד קיים. סלקטיביות יונים בתמיסה עטופים במולקולות מים .ליון האשלגן יש מטען אפקטיבי קטן יותר ,ולכן הוא נע עם שלוש מולקולות מים שעוטפות אותו בעוד שנתרן נע עם ארבע .במעבר בתעלה ,היונים מגיעים לSelectivity - ,Centerהנוצר בפועל על ידי ה.P-Loop- כאשר נתרן מנסה לעבור בתעלת אשלגן ,מעטפת ההידרציה הגדולה שלו מונעת ממנו לעבור. בתעלת הנתרן קיים מרכז הסלקציה ,ובכדי לעבור בו על יון הנתרן לסלק את מעטפת ההידרציה )ולהשקיע אנרגיה( .אנרגיה זו ניתנת על ידי חומצות אמינו טעונות שלילית הפונות למרכז הסלקציה ונקשרות ליון הנתרן באופן רגעי על מנת לייצב אותו למרות השלת מעטפת ההידרציה .כעת הכוח האלקטרוכימי יימשוך אותו פנימה או יידחה אותו החוצה .האשלגן ,שבעקרון קטן מהנתרן כשמשווים חמוטל בן דב החוג לביולוגיה ,אוניברסיטת תל אביב2011-2012 , נושא :7תעלות וטרנספורטרים 111 אותם עם מעטפות ההידרציה ,גדול יותר מהנתרן כאשר שניהם עירומים ממעטפות ההידרציה .מכיוון שהוא גדול יותר הוא לא מתאים למקום המיועד במרכז הסלקציה ולכן אינו עובר הסרת מעטפת הידרציה ואינו נכנס בעד התעלה. התעלות ,למרות היותן פאסיביות ,כן מקיימות קישור מינימלי למיקרו-שניות עם היון; מסיבה זו הן עשויות להגיע לרוויה מסויימת – ולכן העלאת מפל הריכוזים עד אינסוף לא תוביל לעלייה אינסופית במוליכות. גיבוש של התעלות הראה שהתעלה מכילה מספר יונים באיזורים שונים .היונים נדחים אחד מהשני ולכן הנכנסים מלמעלה עוזרים לדחוף את היונים שבמרכז הסלקציה פנימה דרך התעלה .בתמונת הגיבוש ניתן לראות בחלק העליון – 30אנגסטרם – את הרכיב הטרנסממברנלי; כל עומס החלבון שמתחת לזה הוא החלקים הציטופלזמטיים שבלעדיהם התעלה לא תפעל. מודולציה של תעלות מודולציה יכולה להיות בשני מקרים: • הפעלה על ידי פקטור ,ברירת מחדל כבויה; • כיבוי על ידי פקטור ,ברירת מחדל פעילה. פקטורי ההפעלה יכולים להיות מגוונים :מתח חשמלי ,ליגנד ,מתיחה ) .(stretchישנן גם תעלות המופעלות או נסגרות בשילוב גורמים – דוגמת תעלת סידן הנפתחת עקב שינוי מתח ,אך קישור של סידן לחלק התוך-תאי שלה ייגרום לסגירתה. החוג לביולוגיה ,אוניברסיטת תל אביב2011-2012 , חמוטל בן דב מבוא לנוירוביולוגיה 112 דומיין תעלות היונים מכיל סגמנט אחד בעל חומצות אמינו טעונות – במקרה זה ,טעונות חיובית .מתח הממברנה השלילי מקבע את הסגמנט במקום מסויים; דה-פולריזציה תגרום לתזוזה שלו .סגמנט הקשור לשער הסוגר את התעלה ,יביא לשינוי קונפורמציה ופתיחת/סגירת התעלה עקב התזוזה שלו. על מנת לוודא שאלו חומצות האמינו ארגינין וליזין, המועשרות בסגמנט ,4המאפשרות את חישת המתח, יצרו מוטנטים בהם הוחלפו חומצות האמינו ואז בדקו כיצד התעלות הגיבו ,פונקציונלית ,למוטציה. הסגמנט באיור העליון כלוא בתוך שאר הסגמנטים, כאילו כדי לחסום ממנו את הממברנה ההידרופובית הדוחה את מטעניו הרבים; אולם בקריטסטלוגרפיה של התעלה נראה שהחיישן חשוף לממברנה ופועל כמעין דוושה – הוא זז מעלה ומטה בשני מצבים שונים וכך פותח או סוגר את התעלה. אינאקטיבציה לאחר שהתעלה הופעלה ועברה שינוי קונפורמציה יש לחזור למצב האפס; השינוי חזרה יכול לנבוע מסילוק של הגורם שהוביל לשינוי )למשל עצירת הגירוי( אולם במקרים רבים ניתן לראות שהתעלה נסגרת עוד לפני שהגירוי נפסק .ההנחה לנוכח עובדות אלו יצרה את תיאוריית ה,Ball and Chain- הגורסת שלאחר כמה זמן מבנה "כדור" הקשור ב"שרשרת" לתעלה נכנס וחוסם את קצהה הפנימי. על מנת לחזק את תיאוריית "הכדור והשרשרת" הזרימו פרוטאזות )(Pronase שחתכו חלק מהתעלה .כעת נמצא שלאחר שהפעילו את התעלה עם מתח ,התעלה נותרה פתוחה לכל משך הגירוי ופעילותה נפסקה רק עם סוף הגירוי. מה בפועל קורה לתעלה באינאקטיבציה? לכל תעלה יש שלושה שלבים לתגובתה לשינוי המתח :בשלב הראשון ) (1היא סגורה; בשלב השני ) (2היא עוברת אקטיבציה ,כשהשער פתוח והתעלה מוליכה זרם; בשלב השלישי ) (3מתחוללת האינאקטיבציה, כשהתעלה סגורה שוב. חמוטל בן דב החוג לביולוגיה ,אוניברסיטת תל אביב2011-2012 , נושא :7תעלות וטרנספורטרים 113 לאחר הפסקת הגירוי ) (4צריכים להתרחש שני תהליכים :הוצאת הכדור החוסם את התעלה וסגירה של השער שהיה סגור במקור ,על מנת לחזור למצב ) .(1שלב הסגירה של השער לרוב מהיר יותר משלב הסרת המחסום )האינאקטיבציה(. רצפטור לאצטילכולין )(AchR תעלה זו נפוצה במיוחד בסינפסות עצב-שריר ,שם מופרש האצטילכולין מהעצב אל הסינפסה ונקלט על ידי הרצפטור בשריר. נהר וסקמן ) (Neher & Sakmannהשתמשו בPatch-Clamp- והזרימו דרך פיסת ממברנה אצטילכולין cfshלבדוק את המוליכות דרך התעלה .הרישומים הראו שיש שונות גדולה יותר בפתיחות – אבל כל קפיצה שווה בגודלה לאחרת. במחקרים נוספים התגלו הממצאים הבאים: • דרך התעלה זורמים יוני אשלגן ונתרן ביחס של .1:1 בפונציאל ההיפוך של התעלה יזרום יון נתרן אחד פנימה ויצא יון אשלגן אחד החוצה .מכאן שפוטנציאל ההיפוך הוא באיזור ,-10בין פוטנציאל ההיפוך של אשלגן לזה של נתרן. • זמן הפתיחה הממוצע של התעלה הוא 1 ms ובמהלכו זורמים כ 17,000-יונים. היחס שבין פוטנציאל שיווי המשקל לפוטנציאל ההיפוך ייקבע האם הזרימה תהא פנימה החוצה. מתח ממברנה של ) 0-(-10משמעו שאין זרם דרך התעלה ,כי זהו פוטנציאל ההיפוך שלה; אם המתח יהיה נמוך מכך הזרימה תהא פנימה ואם יהיה גבוה מכך הזרימה תהא החוצה. החוג לביולוגיה ,אוניברסיטת תל אביב2011-2012 , חמוטל בן דב 114 מבוא לנוירוביולוגיה ככל שמתח הממברנה עולה כך הכוח המניע של הנתרן פנימה יורד .באשלגן לעומת זאת ,ככל שמתח הממברנה עולה – ככל שנכנסים יותר יונים חיוביים לתא – הכוח המניע את האשלגן החוצה הולך וגדל. מכיוון שה AchR-הוא תעלה שמוליכה את שני היונים ,חיבור הכוחות המניעים יראה שעד פוטנציאל ההיפוך רוב הזרם ניתן על ידי הנתרן הנכנס; מעל לפוטנציאל ההיפוך הזרם של אשלגן החוצה גובה על הזרם של נתרן פנימה .מכיוון שהתעלה מתחילה ממתח הממברנה במנוחה ,היא מתחילה עם הכנסה נטו של נתרן ולכן מעוררת דה- פולריזציה – אקטיבציה – של השריר. ניתן להגדיר את הזרם דרך רצפטור אצטילכולין כשווה לזרם הנתרן וזרם האשלגן דרך התעלה. חמוטל בן דב החוג לביולוגיה ,אוניברסיטת תל אביב2011-2012 , נושא :8תכונות פסיביות ואקטיביות של תאי עצב 115 נושא :8תכונות פסיביות ואקטיביות של תאי עצב ההשפעה של סינפסות על התא הפוסט-סינפטי משתנה בהתאם למיקומה; הזרמת זרם חשמלי לתוך תא שאין בו תעלות תלויות מתח )תיאורטי( דרך אלקטרודה וגרימת דה-פולריזציה תראה שהמתח עולה בהדרגה ,מגיעה למתח גבוה מסויים ,ועם הפסקת הזרם הוא נפרק ודועך. עליית המתח האיטית נובעת מתכונת הממברנה כקבל .התא מורכב מממברנה ליפידית העוטפת אותו ויוצרת אזור סגור ומבודד חשמלית – בו נמצאות התעלות .כושר הקיבול של הממברנה נובע מהצטברות מטענים חיוביים בצד אחד ומטענים שליליים בצד הנגדי; קיבול הממברנה הינו פונקציה של עובי הממברנה .כמו כן יש בממברנה "חורים" – תעלות יונים. כאשר מזרימים זרם חיובי לתוך התא ,הזרם יעבור במקום עם ההתנגדות הנמוכה ביותר .הזרם יכול לעבור דרך התעלות – המשמשות כנגד כי הן יוצרות עיכוב; או שיוכל לטעון את צד הממברנה הפנימי. ברגע שהמטענים יתחילו לטעון את הממברנה חלק מהזרם יתחיל לעבור בתעלות. • הזרם הראשוני מתחיל לטעון את הממברנה. • המטענים החיוביים הצמודים לממברנה יכולים לעבור בתעלה. • עובדה זו גורמת לעליית המתח האיטית בתא לעומת עליית הזרם המהירה ע"י האלקטרודה. היחס בין קיבול הממברנה למוליכות התעלות ייקבע את מהירות קצה טעינת הממברנה כקבל. בסופו של תהליך הממברנה מגיעה לטעינה מלאה, טעינה מירבית ביחס לגודל הזרם המוזרם .משלב זה והלאה הזרם עובר רק דרך התעלות והממברנה נותרת טעונה במתח קבוע ולא מתווסף יותר מטען לממברנה. מה אם התא יהיה גדול יותר? לתא גדול יותר יש יותר ממברנה; מכיוון שיש יותר ממברנה ,יש יותר יכולת קיבול לתא – עוד שטח נגדו יכולים להצטבר מטענים ולכן יוכל להתווסף מתח; מסיבה זו ,בתא גדול יותר יידרש זמן רב יותר על מנת לטעון את הממברנה .העובדה שתא קטן יגיע למתח גבוה יותר בזמן קצר יותר תשפיע על תכונות ה– AP- כמו היצירה שלו ,סומציה וכדומה. החוג לביולוגיה ,אוניברסיטת תל אביב2011-2012 , חמוטל בן דב מבוא לנוירוביולוגיה 116 הקצב הראשוני ניתן לפי קצב טעינת הממברנה; ברגע שהושג מצב אמיד כל הזרם עובר דרך התעלות – דרך הנגד .המכפלה של הזרם בהתנגדות שווה למתח – .V=IRמכאן שאם ידועים הזרם הניתן והמתח המתקבל ,ניתן לחשב את התנגדות התעלות .R=V/I :אינפורמציה זו חשובה ביותר בתחום חקר התעלות .ההתנגדות מכונה ) Input Resistance=Rinהתנגדות הכניסה של התא(. אילו עוד פרמטרים ניתן ללמוד אודות הפאזה העולה של המתח? התפתחות המתח הינה אקספוננציאלית ,ועבור מערכת כזו ,המתח בכל זמן נתון הוא .Vt=IR(1-r-t/τ) :אם הזמן גדול מאודτ , הופך זניח וכל הגורם האקספוננציאלי מצטמצם; מכאן שהמתח בזמן מאוד ארוך – אחרי שהקבל נטען – שווה ל.IR- בזמנים קצרים יותר הגורם האקספוננציאלי הופך משמעותי יותר. τמהווה את קבוע הזמן – הזמן הדרוש להגיע ל- 63%מהמתח המירבי אליו הממברנה יכולה להגיע .31אולם τהוא פונקציה של התנגדות וקיבול ) ;(τ=R*Cמכאן שלא רק לממברנה יש תפקיד בקצב הטעינה אלא גם לתעלות – שכן הן מכתיבות את ההתנגדות. כיצד ניתן לחשב את קיבול הממברנה ) ?(Cmעל ידי חילוץ τלפי זמן הטעינה של הממברנה מחד וההתנגדות לפי משוואת המתח מאידך ,ניתן לחשב את הקיבול כמנה של τבהתנגדות ).(C=τ/R בניסוי תיאורטי נתונים שני תאים ,האחד גדול עם ארבע תעלות ) (Bוהשני קטן עם שתי תעלות ).(A לתא Bיש מוליכות גבוהה יותר )בהנחה שאלו אותן תעלות( כי יש לו יותר תעלות והמוליכות הינה פונקציה של התעלות בלבד .המוליכות שווה ל ,γ=1/R-ולכן ההתנגדות תהיה גדולה יותר בתא ) Aיש יותר התנגדות העוצרת בעד הזרם מלברוח החוצה(. בהנחה שמזרימים אותו גודל זרם I בשני התאים ,היות ו ,V=IR-המתח הגדול יותר ייתפתח בתא בעל ההתנגדות הגדולה יותר. ניתן להסתכל על התעלות בתור חורים בממברנה ,המאפשרים לזרם לדלוף החוצה ) :(leakעובדה זו גורמת לכך שבתא עם יותר תעלות ייבנה פחות זרם ,כי יותר זרם יידלוף החוצה .המתח המירבי תלוי אך ורק במוליכות/התנגדות/נזילות הזרם של התא ואינו תלוי כלל בקיבול הממברנה .הקיבול משפיע רק על קצב הבנייה של המתח ,לא על גודלו הסופי. 31הסיבה היא שאם מציבים במשוואה של המתח t=τמתקבל שהמתח שווה ל 63%-מהמתח המירבי. חמוטל בן דב החוג לביולוגיה ,אוניברסיטת תל אביב2011-2012 , נושא :8תכונות פסיביות ואקטיביות של תאי עצב • • • • אם 117 תא מורכב מממברנה המהווה רכיב קיבול חשמלי ) (Cותעלות המהוות רכיב נגד ).(R ככל שהתא גדול יותר קצב הטעינה ארוך יותר. τהוא קבוע הזמן ,ושווה לזמן הדרוש להגיע ל 63%-מהמתח המירבי. המתח הנבנה הוא פונקציה של הזרם וההתנגדות .ככל שההתנגדות גדולה יותר ,המתח הסופי המירבי גדול יותר. כן ,מתן זרם גורם לשינוי מתח בנוירון; אולי בתנועה לאורך האקסון ,הזרם יידלוף החוצה והמתח יילך ויידעך .דומה הדבר להעברת מים בצינור; אם בצינור יש חורים ,הזרם מאבד מכוחו ובורח דרך החורים ,כך שמילוי הדלי פחות יעיל. אם גורמים לשינוי מתח בנקודה מסויימת באקסון ,ככל שהמתח מתקדם לצדדים הוא דועך והמתח המוקלט בנקודה מרוחקת יהיה הרבה יותר קטן .זוהי ,אם כן ,אינה דרך יעילה להעברה משמעותית ומהירה של סיגנל בין תאים ולאורך האקסון. היונים נאבקים בהתנגדות האורכית של הציטופלזמה ,דבר המוסיף לפיחות בקצב הזרם – עקב תאוטה של תנועת המטענים החשמליים .גם הדעיכה של המתח יכולה להיות מתוארת אקספוננציאלית ,כאשר הקצב של הדעיכה ניתן על פי קבוע המרחק ).(Space/Length Constant המערכת הביולוגית יצרה פטנט ייחודי להעברת המתח ,המכונה פוטנציאל פעולה ) :(APברגע שעוברים את סף פוטנציאל פעולה שינוי המתח שנוצר בממברנה אינו פאסיבי – הוא מאסיבי ולא פרופורציונלי לגודלו של הזרם המקורי. החוג לביולוגיה ,אוניברסיטת תל אביב2011-2012 , חמוטל בן דב מבוא לנוירוביולוגיה 118 פוטנציאל הפעולה פוטנציאל הפעולה ניחן בעלייה מהירה – שינוי של כ 100mV-בתוך מילישנייה אחת ואז ירידה חזקה מטה ,בתוך כמחצית המילישניה ,למתח הנמוך ממתח המנוחה .התהליך מחולק למספר פאזות :הפאזה העולה ,הפאזה היורדת ,והפאזה שלאחר ההיפרפולריזציה ).(undershoot תכונות פוטנציאל הפעולה בניסוי הבא ניתנו שלושה פולסים של זרם בגדלים שונים; הזרם הראשון היה תת-סיפי; שני האחרים הם על-סיפיים והתגובה שהם עוררו היא ירי קצוב של APsכאשר המרווח בין ה APs-ק ֵטן ככל שהמתח גדֵ ל .ניתן לראות שמרגע שנוצר ה ,AP-בין אם ממתח גבוה או נמוך ,הוא מגיע לגודל קבוע ואחיד .כמו כן מרווח הזמן בין הפולס ל AP-הראשון גדול יותר בזרמים קטנים יותר; תקופה זו מכונה .Latency Period אם ה AP-תמיד באותו גודל ,אזי המידע המועבר לתא הבא עשוי בהחלט להיות תדירות הירי .בצורה זו יכול הנוירון להעביר מסרים שונים באותו כלי "חדגוני" של .APמכאן שלא הפוטנציאל הוא המסר אלא התדירות שלו. חמוטל בן דב החוג לביולוגיה ,אוניברסיטת תל אביב2011-2012 , נושא :8תכונות פסיביות ואקטיביות של תאי עצב 119 התקופה הרפרקטורית מוגדרת בתור התקופה בה פולס זרם נוסף אינו יכול לעורר .APהתקופה הזו נחלקת לשניים – תקופה רפרקטורית מוחלטת ,בה לא משנה מה גובה הזרם הניתן ,לא ניתן ליצור ;APותקופה רפרקטורית יחסית ,בה זרמים גדולים מערך הסף עשויים להצליח ליצור ,AP אולם לרוב הוא יהיה קטן יותר .התקופה הרפרקטורית היחסית ארוכה יותר מהמוחלטת. הסיבה לקיומה של התקופה הרפרקטורית היא שב- APהיה אירוע של פתיחת תעלות תלויות מתח; אולם לאחר ה AP-התעלות עברו אינאקטיבציה ועתה הן חסומות .ככל שעוברים את התקופה הרפרקטורית המוחלטת ונכנסים לתקופה הרפרקטורית היחסית ,תהליך האינאקטיבציה של חלק מהתעלות מתהפך והן יכולות להיכנס לפעילות .ככל שממתינים יותר זמן כן ניתן יהיה לקבל APבמתח נמוך יותר ,אולם בכל מקרה הוא תמיד יהיה גבוה יותר מהסף – הניתן לפי מצב בו כל התעלות זמינות לפעילות. • • • על התקופה הרפרקטורית המוחלטת היא התקופה בה כל תעלות הנתרן תלויות המתח נמצאות במצב של אינאקטיבציה ,כולן חסומות. קצב ה"החלמה" והפתיחה-מחדש של התעלות ייקבע את משך התקופה הרפרקטורית. מידת היכולת של תעלות הנתרן ליצור APהיא האקסיטביליות של התא .האקסיטביליות יורדת ל 0-מיד לאחר ה AP-והיא עולה עם הזמן ,כפונקציה של החלמת תעלות הנתרן. מנת לבדוק את סוגי היונים המעורבים ,ניתן להכניס תאי עצב של דיונון למערכת in vitroהמכילה רק סוג יונים אחד בכל פעם ולמדוד מהו שטף הזרימה של היונים במהלך יצירת .APמכיוון שהדיונון גדל במי ים ,הרי שהוא חי בסביבה העשירה בנתרן כלוריד – פי 10מהכמות הפיזיולוגית שיש בסביבה החוץ תאית בגוף האדם .אם ריכוז הנתרן בסביבה ירד ,ה AP-יתרחש אבל יהיה הרבה יותר קטן – במידה יחסית להקטנת הריכוז החיצוני. החוג לביולוגיה ,אוניברסיטת תל אביב2011-2012 , חמוטל בן דב מבוא לנוירוביולוגיה 120 המודל של הודג'קין והאקסלי – Voltage Clamp אם כן ,יוני הנתרן הינם בעלי תפקיד חשוב ביצירת ה ;AP-מעבר לכך ,בריכוז נתרן אפסי לא התקיים APכלל .על מנת לדעת אילו יונים מעורבים בכל פאזה – בפאזה העולה ובפאזה היורדת – הודג'קין והאקסלי פיתחו את ה ,Voltage Clamp-מערכת המאפשרת ללמוד על הזרמים היונים של ה,AP- ופיתחו מודל המסביר איזה יון אחראי על כל שלב בתהליך ה .AP-עד כה הניסויים הזרימו זרם קבוע ומדדו את שינוי המתח; מערכת ה Voltage Clamp-מחזיקה את מתח הממברנה קבוע ומודדת את הזרמים הנדרשים להעביר על מנת לקבע את המתח כך. על מנת לקבל קפיצה מתח בצורת מדרגה במקום בצורת טעינת הקיבול ,נתנו פולס של זרם שהיה גבוה משמעותית ואז התחיל לדעוך; הפולס החזק גורם לטעינה מהירה יותר ,אך גם חזקה יותר ,ולכן הפולס שניתן החל לדעוך עד לרמת הפולס שמביא למתח של .+10mV במערכת ה ,Voltage Clamp-שהיא מערכת משוב ,יוצרים מעגל משוב בין שתי אלקטרודות: האחת מזרימה זרם והשנייה מודדת מתח. האלקטרודה של המתח מבקרת את האלקטרודה של הזרם .בצורה זו ניתן להקפיץ את המתח בצורת מדרגה למתח ה.AP- היונים המעורבים בפוטנציאל הפעולה ה AP-הוא תהליך של דה-פולריזציה; מכאן שאם מקבעים את התא במתח על-סיפי ,תעלות הנתרן תלויות המתח יתחילו להיפתח .פתיחתן וקצב הכניסה של הנתרן יבוקרו על ידי האלקטרודה של הזרם – האלקטרודה תזרים זרם הופכי לזרם הנכנס לתא בכוח התעלות. הזרמים האקטיבים העוברים בממברנה בזמן מתח קבוע על-סיפי .ניתן לקבוע שזה הזרם שעובר דרך תעלות הנתרן והאשלגן תלויות-המתח בעת הגעת מתח הממברנה למתח העל-סיפי .כבר עתה נראה שהזרם האחד מתחיל ונגמר במהירות בעוד שהשני מתחיל בעיכוב ונמשך לאורך זמן. בעת קבלת אות על-סיפי ,שני סוגי התעלות נפתחים .על מנת להפריד בין שני הסוגים ,ולבדוק מהו היון העובר בכל שלב ,ניתן להשתמש בטוקסינים ,דוגמת ,TTXהחוסם תעלות תלויות חמוטל בן דב החוג לביולוגיה ,אוניברסיטת תל אביב2011-2012 , נושא :8תכונות פסיביות ואקטיביות של תאי עצב 121 מתח .בחסימת תעלות נתרן הזרם הנכנס נעלם ונותר זרם יוצא ההולך וגדל בהדרגה .אם משתמשים בטוקסין ,TEAהחוסם תעלות אשלגן ,מופיע זרם הנתרן פנימה במלואו. לרוב APלא מקבל פולס מתח ארוך כמו זה שניתן במערכת הניסוי; אולם ה Voltage Clamp-מאפשרת לתת סיגנל מתח המדמה במדוייק את שינויי המתח המתחוללים בעת .APאם מוסיפים למצב זה גם TEAאו ,TTXניתן לראות בדיוק את סוג היון בעובר בכל אחת מהפאזות השונות של ה.AP- בחסימת תעלות האשלגן מופיע זרם פנימה של נתרן ,מהיר מאוד בהתחלתו ובסיומו .לעומת זאת ,בחסימת תעלות הנתרן ישנה עלייה וירידה איטיות – העוקבות אחר עליית המתח של הAP- בעיכוב ואיטיות משמעותית. ערכי הזרם העובר בכל אחד מהשלבים מאפשר לקבוע מהי המוליכות של כל אחד מהיונים בכל נקודת זמן לאורך ה,AP- מאחר והזרם שווה למנת המוליכות ושינוי המתח )) .(γion=Iion/(Vm-Vionמכאן שהמוליכות לנתרן עולה בחדות בפאזה העולה של ה ;AP-בשיא ה AP-תעלות הנתרן עוברות אינאקטיבציה ובמקביל ,הצטברה כמות משמעותית של תעלות האשלגן שעברו אקטיבציה .כעת אשלגן מתחיל לצאת החוצה ויוצר היפרפולאריזציה – הפאזה היורדת. • פתיחת תעלות נתרן תלויות-מתח אחראי בלבדי לפאזה העולה; • לפאזה היורדת אחראים שני תהליכים – אינאקטיבציה של תעלות הנתרן ,שמונעות המשך עלייה ,ואקטיבציה של תעלות אשלגן המושכות את המתח חזרה מטה. ה AP-לא יורד חזרה למתח המנוחה של הממברנה – הוא יורד מתחתיו ועולה לאט לאט בשל הקינטיקה האיטית של תעלות האשלגן – אשר מחד יוצרת את העיכוב בפתיחתן ומאידך גורמת לעיכוב בסגירתן. • בחסימת תעלות האשלגן על ידי ,TEAהגובה של ה AP-לא יישתנה למדי – כי השיא נקבע על פי הקירבה לפוטנציאל ההיפוך של נתרן והאינאקטיבציה של תעלות הנתרן .השינוי יתבטא בפאזה היורדת ,שתהיה ארוכה ומתונה ובהיעדר היפרפולריזציה מתחת למתח המנוחה – לא תהיה תקופה רפרקטורית מוחלטת. • בחסימת תעלות נתרן עם ,TTXה AP-כלל לא ייתרחש – לא תהיה פאזה עולה כי זו תלויה לחלוטין בפתיחתן תלויית-המתח של הנתרן. עקומת זרם/מתח מלמדת על תלות המתח של תעלת תלויית מתח; לתעלות אשלגן פאסיביות יש פוטנציאל היפוך במתח -70mVולתעלות נתרן פאסיביות יש פוטנציאל היפוך ב ;+50mV-התעלות תלויות המתח עובדות ככל הנראה בתווך – כי ידוע שהן מופעלות במתח על-סיפי ,הגבוה ממתח המנוחה של הממברנה אך נמוך משיא ה) AP-שנמוך מעט מפוטנציאל ההיפוך של .(+50mV החוג לביולוגיה ,אוניברסיטת תל אביב2011-2012 , חמוטל בן דב מבוא לנוירוביולוגיה 122 לשם בדיקה זו מקפיצים את המתח לרמות שונות, בעזרת ,Voltage Clampובודקים מהם הזרמים הפעילים. החל משינוי פוטנציאל המנוחה ל (-10)mV-מתחילים זרמים תלויי מתח )– (1 זרם נתרן נכנס ולאחריו זרם אשלגן יוצא .כאשר הקפיצו למתח דה-פולריזטורי גדול יותר ),(2 התקבלו זרמים חזקים יותר פנימה והחוצה, בהתאמה. כאשר המשיכו להגדיל את הזרמים ) (3-5זרם הנתרן הלך וקטן וזרם האשלגן גדל עד לרמה שנתרן החל לצאת גם הוא מהתא .המסקנה :ככל שהדה-פולריזציה גדולה יותר זרם האשלגן גדל אולם זרם הנתרן מתהפך לפני כן. כאשר מייצרים עקומת זרם/מתח ,ניתן לקבוע ולשרטט את פוטנציאל ההיפוך של זרם הנתרן; לעומת זאת זרם האשלגן עולה אקספוננציאלית – ואין לו נקודת היפוך ניכרת. הכוח המניע של זרם הנתרן מושפע מהמוליכות כמו גם מהכוח האלקטרוכימי; ככל שמתקרבים לפוטנציאל ההיפוך של הנתרן ,הזרמים שלו הולכים וקטנים .מסיבה זו עקומת הזרם/מתח של הנתרן נראית כפי שהיא נראית – ככל שמתקרבים לפונציאל ההיפוך ,הכוח המניע הולך וקטן. המודל של הודג'קין והאקסלי לאחר כל המדידות האלה ,המשיכו הודג'קין והאקסלי ליצירת מודל אמפירי המתאר מתמטית את פעילות התעלות תלויות המתח – כאשר הם מניחים שיש לפחות שני שערים לתעלת הנתרן )לאקטיבציה ואינאקטיבציה( ושער אחד לתעלת האשלגן. ה AP-נוצר בכוח מעגל משוב חיובי :המתח העל-סיפי יוצר דה-פולריזציה קטנה ,אשר הובילה לפתיחת תעלות נתרן תלויות-מתח .נתרן נכנס ומגדיל את הדה- פולריזציה; ככל שהדה-פולריזציה עולה נפתחות עוד תעלות וה AP-מתעצם תוך כדי בנייתו .התופעה הזו מכונה "הכל או כלום. חמוטל בן דב החוג לביולוגיה ,אוניברסיטת תל אביב2011-2012 , נושא :8תכונות פסיביות ואקטיביות של תאי עצב 123 מה ייקבע האם פוטנציאל סינפטי יהיה על-סיפי או לא? האם אלו רק תעלות הנתרן המאסיביות ,שמונעות את הצטברות הדה-פולריזציה על ידי תעלות הנתרן תלויות-המתח ,או שיש דברים נוספים? כל מידה של דה-פולריזציה תקבע כמה תעלות נתרן יופעלו לעומת תעלות אשלגן; הקינטיקה של תעלות הנתרן מהירה יותר משל אשלגן ,והן גם רגישות יותר למתח מתעלות האשלגן ,ולכן קיימת נקודה בה זרם הנתרן נוסק מהר יותר מזרם האשלגן .זוהי נקודת הסף של התא – מכאן זרם הנתרן פנימה יהיה גדול מזרם האשלגן החוצה ולכן תתחיל להצטבר דה-פולריזציה והפעלה של המשוב החיובי. אולם לא רק התעלות משפיעות על התהליך :גם קצב הטעינה ,כלומר קבוע הזמן של הממברנה ,משפיע על משך הזמן שידרש להגיע למתח המפעיל את תעלות הנתרן .בזמן הזה יכולות להיפתח תעלות אשלגן, למרות הקינטיקה האיטית שלהן ,וכך למנוע יצירת APגם עם מתח שבמצב אחר היה נחשב "על-סיפי" )אך שההגעה אליו הייתה איטית(. כיצד פוטנציאל הפעולה מתקדם לאורך האקסון? במהלך APיש דה-פולריזציה חזקה מאוד .הדה-פולריזציה נעה בדיפוזיה משני צידי הממברנה של נקודת ה AP-ותעזור ל AP-להמשיך ולהתקדם קדימה .ה AP-לא יכול לחזור לאחור בגלל התקופה הרפרקטורית. הסיגנל עובר לאורך האקסון; אבל הוא חייב לעבור את האיזור הרפרקטורי שנוצר לאחר ה AP-על מנת שהדה-פולריזציה תוכל לחולל APחדש .מכאן שחייב להיות מעבר דיפוזי של זרם על מנת שהוא יוכל לחדש את עצמו בצורת APחדש. אולם ,זרם דולף; מכאן שעל מנת לעבור דרך אקסונים הולכים וגדלים )ולהגדיל את הגוף ככלל( ,יש להגביר את מהירות המעבר של הזרם לאורך האקסון. • הפתרון של חסרי החוליות הוא הרחבת קוטר האקסון ,על מנת להקטין את ההתנגדות לאורכו ,כך נוצרו אקסוני-הענק האחראים למנגנוני רפלקס הבריחה של האורגניזם; • בבעלי חוליות ,לעומת זאת ,עוברים הרבה יותר נוירונים בתחום הצר של מערכת השלד )חוט השדרה( ויש מורכבות ופלסטיות גדולה יותר שאינה קיימת בחסרי החוליות .מסיבה זו נוצרה מעטפת המיילין – המיועדת להוסיף ליפידים לעובי האקסון. הוספת הליפידים מקטינה את הקיבול של הממברנה )ככל שהמרחק בין לוחות הקבל גדול יותר הקיבול קטן יותר( ולכן פחות זרם "מתבזבז" לאורך האקסון על טעינת הממברנה .כמו כן ,המיילין חוסם את התעלות ובכך מפחית את הזליגה החוצה .הזרם עובר במהירות בעד האקסון ,אינו זולג מבעד לתעלות ואינו מתעכב לטעינת הממברנה .כתוצאה מכך המעבר בין המרווחים שבין עטיפות המיילין ) (Nodes of Ranvier, NoRמהיר מאוד .תעלות תלויות מתח ב NoR-יוצרות APמחדש בכל אחת מהנקודות על מנת לחדש ולהגביר את האות לאורך האקסון .מכאן נובע שמה הנוסף של ההולכה עם המיילין – " – Saltatory Conductionהולכה בקפיצות". החוג לביולוגיה ,אוניברסיטת תל אביב2011-2012 , חמוטל בן דב 124 מבוא לנוירוביולוגיה ישנן מספר מחלות בהן המיילין נעלם ,דוגמת טרשת נפוצה בה הגוף יוצר נוגדנים כנגד מיילין או תסמונת גוליאן-באר בה הגוף מאכל את המיילין; במקרים אלו הדעיכה של הפוטנציאל לאורך המקטע שאמור להיות מכוסה מיילין מהירה ועד שהוא מגיע לנקודה הבאה בה ניתן ליצור AP המתח נמוך מדי ואינו עובר את הסף. איזור ה Axon Hillock-מכיל את ריכוז תעלות הנתרן תלויות-המתח הגבוה ביותר ,ולכן שם ייווצר .AP חמוטל בן דב החוג לביולוגיה ,אוניברסיטת תל אביב2011-2012 ,
